Опийная наркомания. Химико-токсикологический анализ опиатов на примере героина

1.7.4.2. Методы обнаружения  наркотических и  психотропных веществ  в волосах и  ногтях 

     Для предварительного обнаружения наркотических  средств и лекарственных веществ  различных классов в волосах  используются радиоиммунные, иммунофлуоресцентные и иммуноферментные методы с применением коммерческих наборов реактивов и оборудования: RIA, Abuscreen®, Triadge-8™, TDx® и EMIT® и других.

     Преимуществами  данных методов являются: их чувствительность, экспрессность проведения определений, удобство и относительная простота приготовления образцов для анализа. Возможность проведения исследований сразу целых групп химически близких веществ также можно отнести к преимуществам иммунных методов. Чувствительности иммунологических методов достаточно для обнаружения практически всех классов наркотических и психотропных веществ в образцах волос весом от 10 до 100 мг.

     Однако, как показывает анализ литературы, использование иммунных методов  наиболее эффективно при исследовании рассматриваемых объектов на ограниченное количество групп наркотиков, чаще всего одну или две, например, опиаты или кокаин. При исследовании образцов на большее количество групп наркотиков резко возрастает количество операций, необходимых для проведения эксперимента, что снижает эффективность таких исследований.

     Для обнаружения наркотических и  психотропных веществ в волосах  и ногтях, в том числе для  подтверждения результатов, полученных иммунологическими методами, широко применяются флуорометрические, спектральные и хроматографические методы и их комбинации. При этом в подавляющем большинстве работ для повышения чувствительности определения исследуемых веществ авторы используют различные методы их дериватизации и химической обработки. Обнаружение контролируемых веществ в волосах флуорометрическим методом используется для тех из них, которые сами обладают способностью к флуоресценции. Иногда наркотики модифицируют при помощи соответствующих реактивов, что приводит к появлению у них необходимых для рассматриваемого метода аналитических свойств.

     Здесь необходимо отметить, что с появлением в последнее время таких комбинированных методов исследования, как сочетание высокоэффективной жидкостной хроматографии или капиллярного электрофореза с масс-спектрометрией или тандемной масс-спектрометрией, следует ожидать резкого расширения использования их в анализе нетрадиционных объектов на присутствие наркотиков. Особенно это касается методов исследования малоустойчивых соединений: бупренорфина, ЛСД и его аналогов, а также оптических изомеров метадона. Такому расширению, несомненно, будет способствовать и удешевление данного оборудования.

     Метод газовой хроматографии (ГХ) с применением  плазменно-ионизационного, азотно-фосфорного или электронозахватного детектирования мало применим для исследования, что  связано с большим количеством эндогенных и экзогенных веществ, присутствующих в пробе и затрудняющих обнаружение целевых компонентов, от которых на практике трудно избавиться.

     Метод газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) в настоящее время является наиболее часто и широко применяемым для обнаружения и идентификации наркотиков в волосах человека. Типовая схема исследования этим методом включает промывку образцов от внешних загрязнителей, разрушение объекта, экстракцию анализируемых веществ и очистку полученного экстракта. Далее проба обрабатывается дериватизирующим реактивом, например, силилирующим или ацилирующим, и исследуется в режиме сканирования характеристических ионов. Рассматриваемый метод позволяет проводить скрининг объектов на присутствие в них достаточно большого числа веществ одновременно при исследовании одного образца, что выгодно отличает его от иммунных методов.

     Перспективным методом следует считать тандемную  масс-спектрометрию, которая позволяет  определять наркотические средства в одиночном волосе длиной 0,5 см, что особенно полезно при проведении исследований продолжительности потребления наркотиков. Данный метод, однако, ещё не получил широкого распространения.

     В настоящий момент при использовании 20 мг волос пороговыми концентрациями опиатов в них считаются значения на уровне 0,5 нг/мг, определяемые иммунными методами, и на уровне 0,3 нг/мг — хромато-масс-спектральными методами.

     Исследование  волос и ногтей позволяет обнаруживать факт употребления наркотиков в гораздо  более длительные сроки, чем исследование мочи. Таблица 2 представляет типичные сроки, в течение которых обнаруживаются вещества в моче и волосах. 

     Таблица 2.

 

      

1.8. Заключение по  обзору литературы 

     Существующие  методы выделения героина в биологических  объектах имеют ряд недостатков:

• Требуют применения высокотоксичных органических растворителей.
• Используют дорогостоящее оборудование и реактивы.
• Длительность выполнения.
• Имеют  низкую  чувствительность  и  малую избирательность
• (титриметрические методы анализа).
• Приведенными выше методами можно определить не только героин, но и ряд других веществ, что может помешать индивидуальному определению героина в биологических жидкостях.

     Используемые  повсеместно в качестве объектов исследования кровь и моча имеют следующие недостатки:

     1) возможность ложноположительных  результатов из-за умышленного  или случайного загрязнения образцов;

     2) быстрое разложение как самих  образцов, так и исследуемых веществ,  что обусловливает необходимость  проведения исследований в возможно  более короткие сроки после их отбора;

     3) сложности в интерпретации результатов  при выявлении вещества в концентрации, близкой к пределу обнаружения  метода;

     4) узкий временной интервал, в течение  которого искомые вещества находятся  в организме.

     Таким образом, употребление опиатов (героина) может быть выявлено спустя продолжительное время после окончания их приёма при помощи исследования волос. При рассмотрении злоупотреблений героином или его препаратами следует учитывать тот факт, что в волосах основным метаболитом его являются 6-МАМ и морфин. Возможно обнаружение также самого неизменного героина в волосах, что редко наблюдается при исследовании биожидкостей.

     При таком подходе удаётся избежать возникновения целого ряда проблем, характерных для исследования мочи или слюны как таковых.

     В связи с этим является актуальным  поиск новых методов выделения героина из биологических объектов или комбинация уже существующих методик.   
 
 

       
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 

     Используемые  в клинических и химико-токсикологических лабораториях методы исследования на присутствие наркотиков таких объектов, как биологические жидкости (моча, кровь и слюна) и ткани трупа, обычно дают отрицательные результаты спустя 1-3 суток, в отдельных случаях спустя неделю и более. Кроме того при интерпретации полученных результатов иногда возникают определенные трудности. Требуется дополнительная анамнестическая информация, а часто и проведение повторных исследований для установления динамики выведения обнаруженного соединения. Другими словами, анализ биожидкостей характеризует только текущий процесс выведения вещества. При этом следует учитывать, что отбор повторных образцов часто бывает по разным причинам затруднён или невозможен.

     Вместе  с тем, исследование пота, волос, а  также ногтей на наркотики является быстро развивающимся направлением, которое привлекает всё расширяющийся круг исследователей во всём мире.

     К настоящему моменту наибольшее распространение  получили иммунные методы, как методы предварительного обнаружения отдельных групп наркотиков, а также хроматографические и спектральные методы, и их комбинации.  

2.1. Подбор методик анализа на героин 

     После попадания в кровяное русло героин практически сразу метаболизируется в 6-моноацетилморфин (6-МАМ), так что искать героин из-за его быстрого распада в организме смысла нет. Часть моноацетилморфина превращается в морфин, часть в морфин-3-глюкуронид, 6-ацетил-3-глюкуронид и некоторые другие вещества (рис. 8).

     

Рис.8. Метаболизм героина в организме 

     Период  полувыведения героина составляет 3 минуты. До 80 % введённой дозы героина выделяется с мочой за 24 часа, основную массу составляет морфин-3-глюкуронид (50-60 %), морфин (5-7 %) и около 1 % 6-МАМ.

     Таким образом, оценка результатов исследования мочи на опиаты представляется достаточно сложной. Присутствие в моче исключительно морфина или его конъюгатов указывает на употребление человеком чистого препарата морфина или на злоупотребление героином одним или двумя днями ранее.

     Присутствие в моче морфина и кодеина одновременно может свидетельствовать о медицинском использовании препаратов кодеина, в этом случае концентрация морфина ниже, чем кодеина. Употребление терапевтических доз (до 30 мг) кодеина даёт возможность обнаруживать свободный морфин или кодеин только в течение нескольких часов после употребления, хотя другие метаболиты могут быть обнаружены спустя два-три дня после введения. Присутствие кодеина в значительных количествах может указывать на злоупотребление им.

     При низких концентрациях в моче морфина  и кодеина невозможно сделать строго однозначный вывод о продукте, который был употреблен субъектом — морфин это, героин или кодеин. Для доказательства употребления героина необходимо идентифицировать его метаболит 6-МАМ. Следует также иметь в виду, что героин может содержать в качестве примеси, иногда в больших количествах, ацетилкодеин, который при метаболизме даёт кодеин и морфин.

     В связи с этим судебно-химическое исследование на героин должно проводиться  двухступенчато (в начале качественное, затем количественное исследование), обладать возможностью доказательства всех дериватов героина.

     Список  используемых нами методов исследования:

1 –  тонкослойная хроматография (ТСХ)

2 –  спектрофотометрическое определение (СФМ) 

2.2. Подготовка образцов волос к анализу 

     Представленные  на исследование образцы волос массой 30 мг настаиваем с 12 мл этанола в течение 4 часов при комнатной температуре. Затем спиртовые вытяжки фильтруем и упариваем досуха на роторном испарителе при +40°С.

     Сухой остаток растворяем в 0,1-0,2 мл этанола. 
 
 
 

 2.3. Хроматографический анализ волос на героин 

     Для проведения исследования этанольные вытяжки мерным капилляром в количестве 5 мкл наносим на хроматографические пластины для высокоэффективной тонкослойной хроматографии с «Кизельгелем 60», производства фирмы «МЕРК» (Германия), размером 10 на 10 см на расстоянии 1 см от края пластины и друг от друга.

     Одновременно  на пластины в качестве метчиков наносим стандартные растворы 100 мкг/мл исследуемых веществ (морфина, кодеина и героина) в этаноле по 5-10 мкл.

     Хроматографирование проводим в системах:

     1) метанол – 25 % раствор аммиака 100:1,5

     2) циклогексан - толуол - 25 % раствор аммиака 75:15:10

     После удаления растворителя пластинки обрабатываем последовательно двумя разными реактивами:

1. 10% раствор хлорида окисного железа.

     На  желтоватом фоне образовались пятна  от голубого до синего цвета (кодеин и  героин реакции не дают).