3.2.3. Определения оптимального количества ПЦР-продукта.

            Полученный после  амплификации ПЦР-продукт в количестве 4 мкл  плавили в 10 мкл воды при 95°C в течение 10 минут, сразу переносили  в лед. Стрип имеет 8 лунок. В них вносили по 50 мкл раствора для сорбции и по 50 мкл 3М NaCl. В 5 лунках делали 5-кратные разведения следующим образом: в первую лунку вносили 14 мкл расплавленной плазмиды; во 2-ую, 3-ью, 4-ую и 5-ую лунки добавляли по 10 мкл воды; из 1-ой лунки отбирали 2 мкл раствора и переносили во 2-ую лунку, далее из 2-ой лунки переносили 2 мкл в 3-ью и т.д. В 6 и 7 лунки ставили отрицательный контроль, в 8 лунке – положительный. Таким образом получали разведения: 1:5, 1:25, 1:125, 1:625.

             После сорбции проводили гибридизацию по методике, где в качестве зонда использовали биотинилированный ПЦР-продукт. Поскольку данный зонд полностью комплементарен ПЦР-продукту (матрице), то при проведении гибридизации полностью исключается возможность неспецифического связывания матрицы и зонда. 

            В ходе данного опыта  были получены следующие данные:

 

            Данные обработаны с помощью «Excel»:

График 3. Выбор оптимального кличества ПЦР-продукта. 

            Из полученных данных вывод: максимальный сигнал был получен в лунке №3 и концентрацию полученную в этой лунке – 0,024 пмоль – использовали в дальнейших опытах как оптимальную. Характер кривой обусловлен тем, что при недостаточном или избыточным количестве ПЦР-продукта происходит неспецифическое связывание зонда с твердой поверхностью стрипа или ещё во время сорбции ДНК ренатурирует сама на себя. 

            3.3. Оптимизация условий гибридизации.

            Для окончательной  оптимизации условий проведения гибридизации был поставлен следующий опыт. Проводили ассимметричную ПЦР для получения одноцепочечной ДНК. Далее её сорбировали на полистироловых планшетах в следующих объемах: в 1-ой лунке – 1 мкл; во 2-ой – 2 мкл; в 3-ей – 4 мкл; в 4-ой – 6мкл; в 5-ой – 8мкл; в 6-ой – 10 мкл; в 8-ой лунке ставили отрицательный контроль. После сорбции проводили гибридизацию с полностью комплементарным зондом 3-1. 

            В ходе данного опыта  были получены следующие данные:

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

            Данные обработаны с помощью «Excel»:

    

График 4. Оптимизация условий гибридизации. 

            Из полученных данных вывод: максимальный сигнал был получен в лунке №2. Объем, который вносили в эту лунку – 2 мкл – будет использоваться в дальнейших опытах в качестве оптимального для сорбции. Характер кривой обусловлен тем, что при избыточном количестве ПЦР-продукта одноцепочечная ДНК образует вторичные структуры, которые блокируют отжиг зонда на исследуемом участке. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Выводы.

            В ходе проделанной  работы:

            1. был выбран участок гена ВИЧ-1, в котором находятся несколько мутаций, которые являются первичными, перекрестными у нескольких АРВ-препаратов и встречаются в наиболее консервативных участках генома;

            2. были подобраны праймеры для амплификации выбранного участка гена;

            3. были рассчитаны и синтезированы зонды для выявления выбранных мутаций;

            4. были определены оптимальные условия проведения ПЦР;

            5. отработаны методики гибридизации на полистироловых планшетах и на нитроцеллюлозной мембране (дот-блот). В итоге гибридизация на нитроцеллюлозной мембране не была использована в дальнейших исследованиях, а только гибридизация в полистироловых планшетах.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Список  литературы.

            1. Барлет Дж., Галант  Дж. Клинические аспекты ВИЧ-инфекции. Изд. Д. Хопкинса, Балтимор, США, 2007, перевод EnRus, М., 2007. -582 с.

            2. Гловер. Д (ред), 1989 Новое в клонировании ДНК/Под ред. Д.Гловера//М: Мир.- 1989.-367С.

            3. Малдарелли Франк, M.D., Ph.D. Резистентность ВИЧ к лекарственным препаратам. www.eurasiahealth.org.

            4. Маренников С.С., Степанова Л.Г., Носик М.Н.и др. // Вопр. Вирусол. – 1991. – №5. – С. 356-361.

            5. Покровский В.В. Эпидемиология и профилактика ВИЧ-инфекции и СПИД. М., 1996. -246с.],

            6. Покровский В.В., Клиническое течение ВИЧ-инфекции и трудоспособность, Российский научно-методический центр по профилактике и борьбе со СПИДом, - 17с.

            7. Ascher M.S., Sheppard H. W. AIDS as immune system activation: a model for pathogenesis. Clin.exp.Immunol. 1998, 73:165-167.

            8. Baar M.P., Schoot A.M., Goudsmit J. Design and evaluation of a human immunodeficiency virus type 1 RNA assay using nucleic acid sequence-based amplification technology able to quantify both group M and O viruses by using the long terminal repeat as target. J Clin Microbiol. 1999, 37:1813-8.

            9.  Baker CA, Clark R, Ventura F. Et al. Peripheral CD4 loss of regulatory T cells is associated with persistent viraemia in chronic HIV infection. Clin Exp Immunol. 2007, 147:533-9.

            10. Barbaro G., Scozzafara A., Mastrolorenzo A., Supuran C.T. Highly active antiretroviral therapy: current state of the art, new agents and their pharmacological interections useful for improving therapeutic outcome.Curr.Pharm.Des.2005,868-871.

            11. Binsbergen J.M., Siebelink A., Jacobs A. Improved performance of serocon-version with a 4th generation HIV antigen/antibody assay. J.Virol. Methods. 1999, 82:72-84.

            12. Chouquet C, Autran B, Gomard E. et al. Correlation between breadth of memory HIV-specific cytotoxic T cells, viral load and disease progression in HIV infection.

            13. Douek D.C. et al. HIV preferentially infects HIV-specific CD4+ T-cells. Nature. 2002, 417, 95-98.

            14. Gallo R.C. et al. Isolation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS). 1983, Science 220, 865-867.

            15. Giorgi JV, Lyles RH, Matud J.L. et al. Multicenter AIDS Cohort Study. Predictive value of immunologic and virologic markers after long or short duration of HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 2002, 29:346-55.

            16. Greenberg M, Cammack N, Salgo M, Smiley L. HIV fusion and its inhibition in antiretroviral therapy. Rev Med Virol. 2004, 14:321-37.

            17. Grossman Z, Feinberg MB, Paul W.E. Multiple modes of cellular activation and virus transmission in HIV infection: a role for chronically and latently infected cells in sustaining viral replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95:6314-9.

            18. Harrich D, Hooker B., Mechanistic aspects of HIV-1 reverse transcription initiation. Rev Med Virol. 2002, 12:31-45.

            19. Hazenberg MD, Hamann D, Schuitemaker H, Miedema F. T cell depletion in HIV-1 infection: how CD4+ T cells go out of stock. Nat Immunol. 2000, 1:285-9.         

            20. Ho, D. D., Neumann, A. U., Perelson, A. S., Chen, W.,Leonard, J. M. & Markowitz, M. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection. Nature 373:6510 (1995), 123–6.

            21. Kilby JM, Eron JJ. Novel therapies based on mechanisms of HIV-1 cell entry. N.Engl.J. Med. 2003, 348:2228-38.

            22. Kostrikis L.G., Cao Y., Ngai H., Moore J.P., Ho D.D.,  Quantitative analysis of serum neutralization of human immunodeficiency virus type 1 from subtypes A, B, C, D, E, F, and I: lack of direct correlation between neutralization serotypes and genetic subtypes and evidence for prevalent serum-dependent infectivity enhancement.

            23. Kotler DP. Characterization of intestinal disease associated with human immunodeficiency virus infection and response to antiretroviral therapy.  J Infect Dis. 1999, 179 Suppl 3:S454-6.

            24. Luvy J.A. HIV pathogenesis and longterm survival AIDS. 1993, 7 (11): 1401-1410.

            25. Mansky, L. M. & Temin, H. M. Lower in vivo mutation rate of human immunodeficiency virus type 1 than that predicted from the fidelity of purified reverse transcriptase. J. Virol. 69:8 (1995), 5087–94.

            26. Marrack P., Endres R., Shimonkeviz R., Zlotnik A., Dialynas D., Fitch F. & Kappler J. (1983) The major histocompatibility complex-restricted antigen receptor on T cells. II. Role of the L3T4 product. J. exp. Med. 158, 1077.

            27. McMichael AJ, Rowland-Jones SL. Cellular immune responses to HIV. Nature. 2001 Apr 19;410(6831):980-7.

            28. Mellors J.M., Rinaldo C.R.Jr., Gupta P. et al. Prognosis in HIV-1 infection predicted by the quantity of virus in plasma. Science. 1996, 272:1167-1170.

            29. Mittler, J. E., Markowitz, M., Ho, D. D. & Perelson, A. S. Improved estimates for HIV-1 clearance rate and intracellular delay. AIDS 13:11 (1999), 1415–17.

            30. Muro-Cacho C.A., Pantaleo G., Fauci A.S., Analysis of apoptosis in lymph nodes of HIV-infected persons. Intensity of apoptosis correlates with the general state of activation of the lymphoid tissue and not with stage of disease or viral burden. J Immunol. 1995, 154:5555-5566.

            31. O’Neil, P. K., Sun, G., Yu, H., Ron, Y., Dougherty, J. P. & Preston, B. D. Mutational analysis of HIV-1 long terminal repeats to explore the relative contribution of reverse transcriptase and RNA polymerase II to viral mutagenesis. J. Biol. Chem. 277:41 (2002), 38053–61.

            32. Ozel M., Pauli G., Gelderblom H.R. The organization of the envelope projections on the surface of HIV. Arch. Virol. 1988, 100:255-66.

            33. Paoloni-Giacobino, A., Rossier, C., Papasavvas, M. P. & Antonarakis, S. E. Frequency of replication/transcription errors in (A)/(T) runs of human genes. Hum. Genet. 109:1 (2001), 40–7.