Разработка аналога биочипов

">            Стандартная реакция  ПЦР включает множество циклов (25-35), каждый из которых протекает в 3 этапа:

            1 этап – денатурация ДНК (расплетение спирали). Протекает при 93-95°C. Под воздействием температуры разрушаются водородные связи, и цепи ДНК расходятся.

            2 этап – присоединение праймеров (отжиг). Температуру реакционной смеси снижают, и праймеры соединяются с комплементарными им участками ДНК.

            3 этап – синтез цепей ДНК. Осуществляется с помощью ДНК-полимеразы. В качестве затравки этот фермент использует комплементарный матрице короткий 18-25 олигодезоксинуклеотид. Полимераза всегда строит новую цепь в направлении от 5۫- к 3۫-концу ДНК. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор трифосфатные нуклеотиды. Процесс проходит при температуре 70-72°C.

             К концу 1-го цикла ПЦР в растворе содержатся два двухцепочечных фрагмента ДНК, каждый из которых включает в себя одну исходную цепь и одну цепь, образованную по праймерам.

             При 2-ом цикле амплификации все описанные выше этапы повторяются. Происходит денатурация цепей ДНК. Затем каждая из 4 цепей снова взаимодействует с праймерами, и в конечном итоге появляются фиксированные по длине фрагменты, соответствующие искомому фрагменту, ограниченные с двух сторон праймерами – ампликонами.

              Процесс ПЦР отличается цепным характером, т.к. синтезированные ампликоны в дальнейшем сами служат матрицей, на которой протекает процесс копирования. Вследствие этого с каждым новым циклом число копий ДНК увеличивается в геометрической прогрессии, при этом большинство продуктов реакции будут представлять собой ампликоны.  

            1.2. Реактивы: 

            1. dNTP-mix – смесь нуклеотидтрифосфатов, по 2,5мМ (AmpliSens, Россия);

            2. 5-х или 10-х  ПЦР-буфер – 5(10)-кратный реакционный буфер (166 мМ (NH₄)₂SO₄, 670 мМ трис-HCl (pH 8,8 при 25°C), 15 мМ MgCl₂, 0,1% твин-20) (AmpliSens, Россия) ;

            3. Н₂О – деионизированная вода, стерильная, автоклавированная (AmpliSens, Россия);

            4. Праймеры PCR-1/PCR-2 – смесь праймеров 2 мкМ каждого:

            Праймер прямой     5’- CCAAAGGTTAAACAATGGC -3’ (2604-2623) Tm-49,5;

            Праймер обратный 5’-TTTAGATTCTTAAATGGCTCC-3’(3578-3599) Tm-51,9. 

            5. Taq-полимераза - Taq-полимераза DiaTaq-рекомбинантная, 5 ед/мкл (AmpliSens, Россия) ;

            6. Пазмида pBH10, содержащая полноразмерный геном ВИЧ с концентрацией 3 мг/мл. 
 
 

            - микропробирки полипропиленовые  вместимостью 0,2 мл;

            - дозаторы пипеточные  с переменным объемом на 20, 200 и  1000 мкл;

            - наконечники к  дозаторам одноразовые с фильтрами;

            - термоциклер для проведения реакции амплификации. 

            1.3. Приготовление.

            Компоненты смеси  для ПЦР добавляли в той же последовательности как они указаны выше в ″Реактивах″. Самое главное – это то, что фермент нужно добавлять в самую последнюю очередь в общую смесь. Объем смеси в одной пробирке  от 25 до 100 мкл.  

            1.4. Проведение ПЦР.

            Прогрев при 94°C в  течение 10 минут. Температурные режимы: 94°C, 30 сек - плавление; 48,6°C,30 сек – отжиг; 72°C, 1 минута – полимеризация. Хранение при 4°C. Количество циклов – 35.

            2. Электрофорез в  агарозном геле.

 

            2.1. Общие сведения.

            Электрофорез в  агарозном геле – стандартный  метод, используемый для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. С помощью этой простой техники  можно быстро разделить такие  смеси фрагментов ДНК, которые не могут быть разделены другими способами например, центрифугированием в градиенте плотности. Кроме того, при разделении в геле прямо следят за положением ДНК, т.к. полосы ДНК в геле можно окрашивать флуоресцирующим и интеркалирующим в ДНК красителем – бромистым этидием в низкой концентрации. Просматривая покрашенный гель в УФ свете, можно заметить даже 1 нг ДНК.    

            2.2. Реактивы:

            1. Порошок агарозы (Sigma, США);

            2. Вода дистиллированная;

            3. Буфер 5×TBE;

            4. Бромистый этидий  с концентрацией 10 мг/мл;

            5. Краситель бромфеноловый синий. 
 

            - колба коническая  объёмом 200 мл;

            - дозатор пипеточный  с переменным объемом на 20мкл;

            - водяная баня;

            - прибор для электрофореза. 

            2.3. Приготовление агарозного геля для электрофореза.

            1.Добавляли рассчитанное количество порошка агарозы в отмеренный объем электрофорезного буфера: 1,5 грамма агарозы разводили в 100 мл буфера, чтобы получить 1,5% раствор агарозы.

            2.Нагревали взвесь в бане с кипящей водой пока агароза не растворится.

            3.Остужали раствор до 50°С и добавляли бромистый этидий (из водного раствора, содержащего 10мг/мл и хранящийся при 4°С в светонепроницаемом сосуде) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл – 4 мкл бромистого этидия к 100 мл раствора агарозы.

            4. На столике для  заливки геля устанавливали гребенки и заливали раствор.

            5. После затвердевания  геля, удаляли гребенки и помещали гель в электрофорезную кювету.

            6. Добавляли достаточное количество электрофорезного буфера, так чтобы гель был закрыт слоем буфера. 

            2.4. Приготовление электрофоретического буфера (ЭФБ).

            5×TBE:

            - трис – 54 г;

            - борная кислота  – 27,5 г;

            - 0,25 М ЭДТА –  4 мл, pH 8,0;

            Vобщ.= 1 литр.

            Навеску для приготовления  электрофоретического буфера переносили в коническую колбу и доводили общий объем до 1000 мл дистиллированной водой, тщательно перемешивали до полного растворения порошка. 

            В колбу вместимостью 500 мл вносили 100 мл 5×TBE буфера, добавляли 400 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивали, чтобы получить 1×TBE буфер, который необходим для проведения электрофореза. 

            2.5. Проведение электрофореза.

            Раствор ДНК с  красителем бромфенол синий наносили в лунки горизонтального 1,5% агарозного геля и проводили электрофорез при напряжении 30 в/см в течение примерно 15-20 минут.

            3. Осаждение ДНК  этанолом.

            С точки зрения экспериментального использования среди множества известных методик выделения и очистки ДНК наиболее количественным является спиртовой метод.  

            3.1. Реактивы:

            1.Ацетат натрия 3М, pH 5,2;

            2. Этанол 96%;

            3. TE,  pH 8,0. 

            Приготовление TE, pH 8,0  буфера:

            Приготовить 1М раствор  трис-HCl (V=100мл):

            Трис – 15,14 г;

            H₂O – 100 мл;

            HCl – 5, 25 мл (чтобы довести до pH 8,0).

            И дальше смешать  трис-HCl – 5 мл, 1М; ЭДТА – 0,5 мл, 0,5М, довести  до конечного объема – 500 мл. 

            - микропробирки полипропиленовые  вместимостью 1,5 мл;

            - дозаторы пипеточные с переменным объемом на 20, 200 мкл;

            - наконечники к  дозаторам одноразовые с фильтрами;

            - центрифуга настольная  типа Eppendorf; 

            3.2. Выделение ДНК после проведения ПЦР.

            1. Определяли объем раствора ДНК с ПЦР буфером.

            2. Ацетата натрия  добавляли из расчета 0,1V от раствора ДНК.  

            3. Хорошо размешивали. Добавляли 2 объема охлажденного во льду этанола (96%) и снова хорошо размешивали. Охлаждали до -20°C.

            4. Оставляли при низкой температуре, чтобы ДНК выпала в осадок (~ 1 час при -20°C).

            5. Центрифугировали при 0°C (можно и при комнатной температуре). В большинстве случаев достаточно центрифугировать 10 мин в центрифуге при 12000g.

            6. Удаляли надосадочную жидкость. Оставляли пробирку в перевернутом положении на листе фильтровальной бумаги, чтобы как следует стекла вся жидкость. Капиллярной пипеткой удаляли все капли со стенок пробирки.

            7. Растворяли осадок ДНК (часто невидимый) в соответствующем объеме TE буфера. Для ускорения растворения осадка можно прогреть пробу при 37°C в течение 5 мин.

            Для того чтобы убедиться, что в растворе присутствует ДНК, с полученным раствором осадка ДНК проводили электрофорез. Для этого 5 мкл раствора и 1 мкл красителя бромфенол синий, вносили в лунку и проводили форез в течение 15-20 минут.

            4. Гибридизация на  мембране (дот-блот).

 

            4.1. Реактивы.

            1. [×20] SSPE;

            2. [×6] SSC;

            3. SDS, 10 %;

            4. р-р Денхардта  [×50];

            5. ЭДТА, 0,5М;

            6. ДНК неспецифическая, 10 мг/мл;

            7. Конъюгат с разведением  1:50;

            8. Субстрат. 

            4.2. Проведение гибридизации.

            1. Разлиновывали  мембрану карандашом.

            2. Смачивали мембрану  в [×20] SSPE.

            3. Смешивали 1:1 ДНК  и [×20] SSPE.

            4. Наносили на  мембрану в центр поля по 1÷5  мкл смеси ДНК с SSPE.

            5. Высушивали на  воздухе 1 час.

            6. Пришивали ДНК  к мембране при УФ в течение  5 минут.

            7. Погружали мембрану  в [×6] SSC на 2 минуты.

            8. Готовили раствор  для предгибридизации.  

             Из расчета  V_общ.=100 мл, добавить:

                - буфер  [×6] SSC                             – 30 мл;

                - SDS, 10 %                                      – 5 мл;

                - р-р Денхардта  [×50]                     – 10 мл;

                - ДНК неспецифическая, 10 мг/мл – 1 мл.

            Вносили раствор  в чашку Петри для предгибридизации из расчета 0,2 мл на 1 см²  мембраны.

            9. Инкубировали 2-4 ч,  погрузив в водяную баню на 68°C.

            10. Сливали раствор  для предгибридизации.