Оглавление. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Введение.

            Актуальность  проблемы.

            Проблема  ВИЧ-инфекции является одной из наиболее актуальных проблем человечества. В настоящее время мир переживает пандемию инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекция) [1], которая вследствие таких ее особенностей, как длительное течение и смертельный исход, наносит человечеству невосполнимый ущерб, унося ежегодно миллионы жизней. Миллионы людей в мире уже инфицированы ВИЧ и каждую минуту происходит новое заражение вирусом. Человек, однажды зараженный ВИЧ, не может избавиться от этого вируса. ВИЧ медленно, но неуклонно разрушает защитную систему организма человека. Развивается недостаточность иммунной системы (иммунный дефицит). Организм человека, зараженного ВИЧ, перестает сопротивляться микроорганизмам, которые обычно не представляют угрозу для здорового человека. Болезни, вызываемые ими, называют оппортунистическими или сопутствующими заболеваниями. При возникновении у зараженных ВИЧ людей этих инфекционных заболеваний врачи констатируют наличие синдрома приобретенного иммунного дефицита (СПИДа) [2].

                        Единственным известным на сегодняшний день средством, препятствующим прогрессии заболевания, является комбинированная антиретровирусная (АРВ) терапия. С каждым годом возрастает потребность в эффективной терапии        ВИЧ-инфекции, что влечет за собой расширение рынка имеющихся и новых препаратов и дополнительно стимулирует исследования, направленные на поиск новых средств против ВИЧ.

                        Из-за точечных замен в геноме ВИЧ мутирует и, вследствие этого, быстро приобретает резистентность к существующим препаратам. На сегодняшний день нет антиретровирусного препарата, к которому ВИЧ не смог бы сформировать резистентность. Мутации возникают быстро и беспрепятственно — иногда для развития устойчивой резистентности достаточно одной мутации, в других случаях степень резистентности возрастает по мере накопления мутаций, каждая из которых усиливает устойчивость вируса к АРВ-терапии. Поэтому необходимо быстро и своевременно определять появление мутаций, ведущих к появлению резистентности. Одним из методов, позволяющих это делать, является использование биочипов.

            Эта технология позволяет  использовать сравнительно небольшое  количество исходного материала, проводить  реакцию в микрообъемах и одновременно выявлять множество точечных мутаций генов одного и того же объекта.

            Наибольшее распространение в исследовательской и клинической практике, особенно для анализа спектра различных мутаций или аллельных вариантов разных генов, получили ДНК-чипы. С помощью этих биочипов можно анализировать и такие изменения ДНК, как транслокации, дупликации, протяженные делеции, а также микродупликации и микроделеции. В типичном варианте они представляют собой миниатюрные пластинки с многочисленными гелевыми ячейками, содержащими набор ДНК-зондов, и расположенные на стекле или мембране.

            Однако эта методика требует дорогостоящего оборудования.

            Цель  работы: изучить возможность создания биочипов для выявления точечных мутаций в геноме ВИЧ-1 в полистироловых планшетах.                                                 

            Задачи  исследования:

            1. Выбрать участок гена ВИЧ-1, в котором находятся несколько мутаций, которые являются первичными, перекрестными у нескольких АРВ-препаратов и встречаются в наиболее консервативных участках генома;

            2. подобрать праймеры для амплификации выбранного участка гена;

            3. рассчитать и  синтезировать зонды для выявления выбранных мутаций;

            4. определить оптимальные условия проведения ПЦР;

            5. отработать и сравнить методики гибридизации на полистироловых планшетах и на нитроцеллюлозной мембране (дот-блот). 
 
 
 
 

Обзор литературы.

            История открытия ВИЧ.

            Группа ученых Национального  института рака в США, руководимых  известным иммунологом и вирусологом  Робертом Гало (R.C. Gallo), открыла возбудитель Т-клеточного лейкоза – заболевания, зарегистрированного в конце 70-х годов в странах Карибского бассейна и в Южной Японии. Лейкоз протекал очень тяжело: больные погибали в течение 3-4 месяцов. Возбудителем острого Т-клеточного лейкоза у человека оказался ретровирус. Галло назвал “свой” агент вирусом Т-клеточной лейкемии человека - HTLV-1 [14]. Он предположил, что вирус возник в Африке, где им заразились приматы Старого Света и человек, а в Америку и страны Карибского бассейна вирус проник благодаря работорговле.

            Культивирование вируса стало возможным после открытия Гало в середине 70-х годов фактора роста Т-клеток, который сейчас называют интерлейкином-2.

                        Выяснилось, что у многих видов  африканских обезьян в крови  содержатся антитела к HTLV-1. Некоторые  разновидности вируса, особенно  выделенные у зеленых мартышек и шимпанзе, имели много сходного с HTLV-1. В дальнейшем оказалось, что HTLV-1 передается при переливании крови. В 1982 г. Гало был выделен еще один вирус этой группы, вызывающий редкое заболевание крови - HTLV-2.

            Как раз  в это время в США началась эпидемия СПИДа. У заболевших СПИД резко истощается популяция Т-лимфоцитов и, кроме того, эпидемиологические параметры нового заболевания СПИД (заражение через кровь, половые контакты и трансплацентарно) такие же, как у Т-лейкозов, вызываемых вирусами HTLV-1 и 2 в эндемичных районах. Поэтому Галло предположил, что возбудителем СПИДа являются данные ретровирусы. И действительно у некоторых больных удалось выделить антитела к HTLV-1, а у части удалось выделить и сам вирус.

            В это же время в Пастеровском институте в Париже, под руководством Люка Монтанье (L. Montagnier) была создана научная группа с целью изучить возможную связь ретровирусов с опухолевыми заболеваниями иммунной системы, выражающимися в увеличении лимфатических узлов (лимфаденопатии). Для культивирования этих вирусов французские ученые использовали открытый группой Галло интерлейкин-2. При исследовании одного пациента, болевшего лимфаденопатией в течение нескольких лет, из клеток лимфатического узла больного был выделен вирус, идентифицированный как ретровирус. По своим свойствам он был похож на HTLV-1, но имел некоторые особенности. Затем аналогичный вирус выделили от больных СПИДом.

            В 1983 году журнал “Science” напечатал статью французских ученых. Они сообщали о наличии у 2 из 33 больных СПИДом ретровируса, который, в отличие от HTLV-1, не обладал способностью влиять на злокачественное перерождение                      Т-лимфоцитов. Авторы дали ему название LAV – lymphadenopathy-associated virus (вирус, ассоциированный с лимфоаденопатией). Он вызывал не размножение, а, наоборот, гибель Т-лимфоцитов [14].

            Между обеими группами ученых начался интенсивный  обмен идеями и биологическими материалами. Группа Галло, используя разработанные ею методы, выделила от больных СПИДом новый ретровирус, названный HTLV-(human T-cell leukemia virus)-3. Удалось получить линию Т-лимфоцитов, в которой вирус интенсивно размножался, но Т-клетки не погибали. В начале 1984 года американцы сообщили об открытом ими вирусе в печати. Вскоре было показано, что HTLV-3 и LAV идентичны, поэтому вирус стали обозначать как HTLV-3/LAV. В 1986 году Комитет по таксономии и номенклатуре вирусов предложил дать возбудителю СПИДа новое название – HIV (Human Immunodefficiency Virus)/ВИЧ (вирус иммунодефицита человека).

Таксономическое положение и генетическое разнообразие ВИЧ.

            ВИЧ относится к  роду Lentivirus, подсемейства Lentiviridae, семейства Retroviridae.

            Ретровирусы – обширное семейство вирусов, выделенных от млекопитающих  и человека. Название семейства связано  с ферментом, который называется обратная транскриптаза (ревертаза, РНК-зависимая-ДНК-полимераза). Обратная транскриптаза содержится в составе вирионов и является катализатором обратной транскрипции.

            Все ретровирусы  имеют ряд общих свойств. Они  содержат до 2% РНК, около 65%белков (5-8 различных  полипептидов), около 30% липидов и 2% углеводов. Их вирионы имеют сложную структуру. Капсид, построенный по кубическому типу симметрии, снаружи окружен липопротеиновой внешней оболочкой с шиповидными отростками. Ретровирусы имеют диплоидный геном, представленный двумя идентичными копиями «плюс» однонитевой РНК. С вирусным геномом ассоциирована вирусспецифическая обратная транскриптаза, необходимая для образования ДНК провируса, интегрирующего в геном клетки хозяина. После проникновения в клетку-хозяина вирусная РНК служит матрицей для синтеза двуцепочечной ДНК с помощью вирусной ревертазы. Затем вирусная ДНК встраивается в состав генома клетки-хозяина с помощью вирусной интегразы и некоторых клеточных ко-факторов. Таким образом, вирусный геном становится транскрибируемым. Далее возможно развитие событий по двум сценариям: 1) латентная вирусная инфекция или 2) продуктивная вирусная инфекция с образованием дочерних вирионов. Выход зрелых вирионов из клетки происходит путем почкования от наружной  клеточной мембраны.

            Представители подсемейства лентивирусов занимают особое место среди ретровирусов. Это возбудители медленных (лат. lente – медленно) смертельных инфекций, сопровождающихся развитием анемий, поражением ЦНС, легких и суставов.

            В состав рода Lentivirus входят 5 групп вирусов; принадлежность к группе определяется по тропности к различным видам млекопитающих (приматы, овцы, козы, кошки, лошади, крупный рогатый скот). Выделяют два типа вируса, патогенных для человека: ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Оба вируса передаются через кровь, половым путем, трансплацентаро, но ВИЧ-1 более вирулентный и является преобладающим возбудителем ВИЧ-инфекции.

            ВИЧ-инфекция медленно прогрессирующее инфекционное заболевание, последняя стадия которого известна как синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Возбудителем ВИЧ-инфекции является вирус иммунодефицита человека, поражающий, преимущественно, клетки иммунной системы (CD+ Т-лимфоциты, макрофаги и дендритные клетки) [13]. ВИЧ-1 делится на подтипы (субтипы), обозначаемые буквами от А до К (объединены в группу М, англ. Major – больший, составляющий большую часть) и О (англ. Outlier – в стороне). В 1998 году была открыта еще одна группа вирусов, обозначенная буквой N (англ. New – новые). По классификации 2005 года, субтипы А и F подразделяются на подсубтипы А1, А2, А3 и F1, F2, F3, соответственно. Субтипы ВИЧ-1 группа М – А, В, С, D, E, F, G, H, J, К и субтипы ВИЧ-1 группы О выделяют в зависимости от строения фрагментов гена env. У вирусов группы О обнаруживается 55-70% гомологичных последовательностей с вирусами группы М. Все разновидности ВИЧ-1 встречаются на Африканском континенте. Больше всего случаев ВИЧ-1 инфекции в мире вызвано субтипом С (эпидемии в Индии и Южной Африке). Субтип В распространен в Северной и Южной Америке, Западной Европе, Австралии и Японии. На территории Российской Федерации в настоящее время циркулируют 3 варианта ВИЧ-1 группы М: субтип А, субтип В и рекомбинантная форма А/В, с преобладанием на большей части страны субтипа А (более 94%).

            ВИЧ-2 – вирус иммунодефицита человека, который был идентифицирован в 1986 году. Он уступает ВИЧ-1 по патогенности и встречается, преимущественно, в странах Западной и Центральной Африки, например, в Гвения-Бисау, Анголе, Мозамбике. Считается, что прогрессирование иммунного дефицита, вызываемого ВИЧ-2, идет несколько медленнее, чем при заражении ВИЧ-1. Однако показатели смертности среди лиц, инфицированных ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с одинаковой вирусной нагрузкой практически не отличаются. Отмечено, что люди, инфицированные ВИЧ-2, обладают слабым иммунитетом к ВИЧ-1. Сходными свойствами с ВИЧ-2 обладает вирус иммунодефицита обезьян (ВИО, или SIV, англ., Simian Immunodeficiency Virus).  

            Строение ВИЧ.

            Вирионы ВИЧ имеют  сферическую форму, 100-120 нм в диаметре. И по своей структуре близки к другим лентивирусам.

Рис. 1. Структура ВИЧ. 

            Наружная мембрана вируса пронизана собственными белками (оболочечные белки) gp 41 и gp120, получившими  название от слова “glicоprotein”, c молекулярной массой 41 и 120 кД. Эти белки образуют 72 отростка на поверхности мембраны вируса, каждый состоит из 3 молекул gp120. Молекулы gp120 могут отрываться от вирусной частицы и с током крови поступать в ткани, что играет существенную роль в патогенезе ВИЧ-инфекции [32].

            Конусовидная сердцевина вириона ВИЧ заключена в липидную оболочку. Сама сердцевина состоит из нуклеокапсидного белка р24 с молекулярной массой 24 кД. Внутри нуклеотида заключены геном вируса (две молекулы РНК), белок с молекулярной массой 7 кД и комплекс ферментов: обратная транскриптаза, протеаза и интеграза(рис. 1).

            Характеристика  генома ВИЧ.

            Вирионы ретровирусов имеют 6 структурных белков, из них 4 внутренних (капсидных) негликолизированных и 2 гликопротеина оболочки. Капсидные белки несут группоспецифические межвидовые антигены и являются основой для разделения вирусов на роды и подроды.

            Основными структурными генами кодирующими трансляцию белков, из которых в последующем строится вирус, являются gag (group — specificantigens), pol (polymerase), env (envelope). В геноме ВИЧ-1 находится группа генов, названных неструктурными или регуляторными, к ним относятся: tat (трансактиватор всех вирусных белков), rev (регулятор экспрессии вирионных белков), vif (вирионный инфекционный фактор), vpr (функции остаются неясными), nef (негативный фактор экспрессии) [2]. См. рис. 2.