Разработка аналога биочипов

            Материал также  исследуют методами электронной  микроскопии; определяют содержание уровня АГ вируса методами ИФА и иммунофлюоресцентного  анализа, измеряют активность обратной транскриптазы вируса. Поскольку исследование трудоемкое и длительное оно не нашло широкого применения в качестве диагностического метода исследования [4]. 
 
 
 
 
 
 
 

            Лечение ВИЧ-инфекции.

            Лечение ВИЧ-инфекции включает:

               • подавление репликации ВИЧ в организме с помощью противоретровирусных препаратов;

               • купирование  осложнений, развивающихся на фоне  противовирусной терапии;

               • химиопрофилактику вторичных заболеваний [21].

            Дополнительно, в  зависимости от фазы болезни, проводят лечение инфекционных и неинфекционных осложнений, а также лечение сопутствующей патологии.

            Основа лечения  – это высокоактивная противовирусная  терапия (ВААРТ): комбинированная терапия тремя или более препаратами с разным механизмом действия, воздействующих на разные стадии жизненного цикла ВИЧ. Цель терапии – полное подавление репликации вируса (см. Табл.2) [16]. ВААРТ замедляет прогрессирование ВИЧ-инфекции и её переход в стадию СПИДа. Теоретически, при условии сохранения эффективности действия лекарственных препаратов, продолжительность жизни ВИЧ-инфицированного может ограничиваться естественными процессами старения.

            Применение  ВААРТ позволяет:

               • увеличить  продолжительность жизни больных  и улучшить качество жизни;

               • снизить  вирусную нагрузку до минимального  уровня (до <50 копий/мл) и  удерживать  ее на этом уровне в течение длительного времени;

               • восстановить функцию иммунной системы: как количественные (повышение количества CD+ Т-лимфоцитов до нормального уровня), так и качественные показатели (восстановление адекватного специфического иммунного ответа) [23].

            Существенным недостатком  всех противовирусных препаратов является их неспособность полностью устранить  ВИЧ из организма. Рано или поздно вирус мутирует, приобретая резистентность к применяемым лекарственным  формам, что выражается в способности  проникать в человеческие клетки и размножаться в присутствии противовирусных препаратов. На фоне противовирусной терапии полная замена вируса дикого типа на резистентный может произойти за 14-28 дней. Также во многих случаях пациент не может принимать отдельные препараты по причине индивидуальной непереносимости. Поэтому применение терапии чаще всего лишь отсрочивает на несколько лет развитие СПИДа.

            Для предотвращения развития побочных эффектов и образования  резистентных форм вируса, составляются различные комбинированные схемы лечения с использованием как можно более широкого спектра противоретровирусных препаратов. Для устойчивого подавления репликации вируса необходимо, чтобы схема лечения включала назначение не менее двух противоретровирусных препаратов (оптимальным признано назначение трех лекарственных форм), к которым чувствителен вирус у конкретного пациента. Поэтому исследования на резистентность к противоретровирусным препаратам является обязательным при проведении ВААРТ [10]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Таблица 2. Противоретровирусные препараты.

            Резистентность   к АРВ-препаратам.

            В отсутствии средств  специфической профилактики инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), на первый план выходит противовирусная терапия. Однако важнейшей проблемой, осложняющей терапию ВИЧ-инфекции, является приобретение вирусом устойчивости к действию лекарственных средств. Несмотря на большие успехи в разработке противоретровирусных препаратов, на сегодняшний день не известно ни одного препарата, ни одной схемы лечения, применение которых не сопровождалось бы формированием резистентных штаммов ВИЧ. В зависимости от метода, с помощью которого определяется резистентность ВИЧ к АРВ-препаратам (АРВП), используются понятия фенотипической и генотипической резистентности [3].

            Фенотипическую резистентность определяют, как способность ВИЧ реплицироваться при высоких концентрациях антиретровирусных препаратов (АРВ-препараты). Резистентность вируса к препарату обычно оценивают по концентрации препарата, снижающей репликацию вируса на 50% (IC₅₀). Разделив IC₅₀ исследуемого вируса на IC₅₀ контрольного штамма, можно узнать, во сколько раз исследуемый штамм устойчивее к данному АРВ препарату, чем вирус дикого типа.

            Генотипическая резистентность определяется как наличие в геноме ВИЧ мутаций, вызывающих устойчивость к АРВ препаратам. Концепция генотипической резистентности возникла в связи с тем, что методы секвенирования ДНК, используемые для характеристики мутаций, более практичны и безопасны, чем методы, основанные на культивировании ВИЧ. Генотипическую резистентность выражают как изменения в нуклеотидной последовательности гена, кодирующего вирусный белок, являющийся мишенью действия АРВ-препаратов. Поскольку основными АРВ-препаратами для лечения ВИЧ-инфекции являются ингибиторы обратной транскриптазы и протеазы ВИЧ, то мутации именно в этих генах приводят к развитию лекарственной устойчивости.

            Выделяют два вида мутаций устойчивости ВИЧ-1. Первичные  мутации непосредственно вызывают снижение чувствительности вируса к противоретровирусным препаратам, но при этом, как правило, ухудшают его репликативную способность. Вторичные мутации не влияют на уровень лекарственной устойчивости, но в большей или меньшей степени восстанавливают репликативную способность вируса, несущего первичные мутации. Если селекция первичных мутаций всегда является следствием воздействия лекарственных препаратов, то вторичные мутации могут появляться в геноме вируса спонтанно, а у некоторых генетических подтипов ВИЧ-1 даже присутствовать постоянно как проявление генетического полиморфизма, поэтому вторичные мутации называют также мутациями полиморфизма. По некоторым данным, присутствие в геноме вторичных мутаций до начала АРВ терапии снижает эффективность терапии.

            Генотипические методы определения резистентности являются менее дорогостоящими и более быстрыми (и, соответственно, используются более широко), однако интерпретация информации, полученной с их помощью, довольно сложна. Дело в том, что точное воздействие каждой мутации на чувствительность к лекарственному препарату интерпретируется неоднозначно, поскольку при наличии нескольких мутаций важно взаимодействие между ними. Даже когда присутствует одиночная мутация, ее фенотипическое проявление в форме резистентности может быть неполным.

            Методы  выявления мутаций, приводящих к формированию резистентности: секвенирование, биочипы.

            Секвенирование.

            Секвенирование ДНК  позволяет получить информацию обо всех нуклеотидных заменах в выбранном фрагменте генома ВИЧ, в том числе о мутациях, вызывающих устойчивость к АРВ-препаратам.  

             В процессе секвенирования выявляются нуклеотидные последовательности участков генома ВИЧ, где происходят мутации резистентности; обычно исследуется РНК ВИЧ, выделенная из образцов плазмы. Методика непосредственного определения нуклеотидной последовательности РНК невероятно сложная, трудоемкая и дорогостоящая, поэтому РНК ВИЧ сначала подвергается обратной транскрипции in vitro (с помощью обратной транскриптазы, добавляемой к образцу РНК ВИЧ) с образованием провирусной ДНК, которая и подвергается секвенированию.

             Процедура секвенирования ДНК в настоящее практически полностью автоматизирована и не требует больших затрат времени и денег. Для того чтобы получить достаточно материала для обнаружения мутаций резистентности, полученную провирусную ДНК необходимо амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Мутации резистентности в продукте ПЦР-амплификации можно выявить различными способами. Можно просто секвенировать изучаемую провирусную ДНК и сравнить полученную последовательность нуклеотидов с принятой за стандарт последовательностью нуклеотидов провирусной ДНК вируса дикого типа, выявляя изменения, связанные с резистентностью к лекарственным препаратам. При стандартной процедуре секвенированию подвергаются только участки генома, в которых происходит большинство мутаций резистентности — это ген протеазы и часть гена обратной транскриптазы. Ген ОТ довольно большой, но исследования показали, что мутации резистентности сосредоточены на участке, кодирующем аминокислоты в позициях 1–400, поэтому секвенированию подвергается только этот участок.

             Резистентность к ингибиторам протеазы может быть обусловлена или усилена мутациями гена, кодирующего белок-предшественник Gag/Pol, которые приводят к изменениям в участках, подвергающихся протеолизу. Эти мутации происходят за пределами гена протеазы и участка гена обратной транскриптазы и поэтому не обнаруживаются при выполнении стандартной процедуры. Полученные нуклеотидные последовательности расшифровывают с помощью генетического кода, определяя соответствующие им аминокислотные последовательности. Выводы о резистентных свойствах исследуемого вируса делают на основании выявления известных мутаций резистентности.

             Секвенирование позволяет получить лишь усредненные данные о том, какие мутации резистентности присутствуют в общей популяции вируса; при этом выявляются только те мутации, которые присутствуют не менее чем у 20–25% вирионов. Данное ограничение значимо для клинической практики, поскольку в организме пациента могут быть резистентные варианты в количестве, недостаточном для обнаружения. Это особенно характерно для пациентов, которые в прошлом принимали определенные АРВ препараты, но не принимают их на момент проведения исследования на резистентность. Однако эти варианты способны быстро стать доминирующими при возобновлении приема определенных АРВ препаратов [3].

            Обратная  транскрипция и полимеразная цепная реакция.

            Для проведения секвенирования необходимо, чтобы вирусная нагрузка была выше определенного уровня. Концентрация РНК ВИЧ в плазме крови должна быть достаточной для успешного синтеза провирусной ДНК; обычно требуется, чтобы у пациента вирусная нагрузка была не менее 1000 копий/мл. Иногда не получается амплифицировать образцы с концентрацией РНК ВИЧ 1000–5000 копий/мл, и вместе с тем были случаи, когда удавалось амплифицировать образцы с меньшей вирусной нагрузкой. 

            Для проведения реакции  обратной транскрипции выделенная РНК инкубируется в реакционном буфере, содержащем фермент обратную транскриптазу, например, Moloney Murine Leukemia Virus (MuLV) для получения однонитевой комплементарной ДНК (кДНК).

            Полученную кДНК можно хранить в холодильнике при температуре от -15°С до -25 °С до проведения ПЦР не более двух недель или при -70 °С - длительно.

            В ходе ПЦР может  нарабатываться как один общий фрагмент, включающий ген протеазы и 2/3 гена обратной транскриптазы, так и несколько  фрагментов. Кроме того, наработка  ампликона может проходить в  один раунд либо в два раунда (так  называемая, Nested-ПЦР). Во втором раунде ПЦР используется дополнительная пара праймеров, которая локализуется внутри ампликона, полученного в первом раунде.