Разработка аналога биочипов

             По стандартной методике количество праймеров в пробирке объемом        25 мкл может быть 0,1мМ – 1,0мМ.

            Для определения  оптимальной концентрации праймеров отдельно делали разведение праймеров: сначала каждый праймер развели до концентрации 4,4 пмоль/мкл каждый. Потом сделали смесь этих праймеров и добавили в 3 пробирки в количестве 1мкл, 2 мкл и 3 мкл с концентрацией 2,5 пмоль/мкл.

            Далее проводили 35 циклов амплификации в автоматическом термоциклере.

            Полученную ДНК  после амплификации отбирали в количестве 5 мкл и проводили электрофорез в агарозном геле. Результаты представлены на рис.5. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 Дорожки:                                1                 2                3                                 4

            

Рис. 5. Определение оптимальной  концентрации праймеров.

Дорожки: 1 – 1,1 пмоль каждого праймера; 2 – 2,2 пмоль каждого праймера; 3 – 3,3 пмоль каждого праймера; 4 – маркер. 

            На  Рис.5 после электрофореза наблюдаем, что на первой и второй дорожках ничего нет, на третьей видим четкий сигнал. Значит это и есть необходимое минимальное количество праймеров.

            В дальнейшем мы использовали в реакцию на 25 мкл по 3,3 пмоль/мкл каждого праймера

            .

            I.3.3. Определение оптимальной концентрации ионов магния.

            По стандартной  методике количество ионов магния в пробирке объемом 25 мкл может быть 2,2мМ – 5,0мМ.

             В 4 пробирки добавляли в общую ПЦР-смесь различное количество ионов магния таким образом, чтобы: в первой пробирке концентрация Mg²⁺ была 2,2 мМ, во второй пробирке – 3,0 мМ, в третьей – 4,0мМ, в четвертой – 5,0мМ.

            Далее проводили 35 циклов амплификации в автоматическом термоциклере.

            Полученную ДНК  после амплификации отбирали в количестве 5 мкл и проводила электрофорез в агарозном геле. Результаты представлены на рис.6. 
 
 
 
 

 Дорожки:                                   1                      2                   3                      4

                         

Рис. 6. Определение оптимальной  концентрации ионов  магния.

Дорожки: концентрация Mg²⁺:   1 – 2,2 мМ;  2 – 3,0 мМ;  3 – 4,0мМ;  4 – 5,0мМ. 

            На  Рис.6 после  электрофореза  наблюдаем, что интенсивность  сигналов  примерно одинаковая, поэтому мы решили использовать стандартную концентрацию ионов магния, которая уже присутствует в смеси для ПЦР – 2,2мМ. 

            1.4. Асимметричная ПЦР.

            Для получения одноцепочечной ДНК ставили асимметричную ПЦР. Это необходимо для того, чтобы убрать из процесса гибридизации стадию денатурации    ПЦР-продукта.

            Поскольку зонды  подбирались по последовательности лидирующей цепи ДНК (″+″-цепь), то они  должны в процессе гибридизации комплементарно связываться с отстающей цепью (″-″ - цепь). Поэтому нам необходимо было наработать ″-″ - цепь ДНК.

            Сначала ставили  ПЦР для получения обычного двуцепочечного продукта.  Далее из этой пробирки отбирали 2 мкл продукта в качестве матрицы для постановки асимметричной ПЦР. Для получения ″-″ - цепи в ПЦР-смесь добавляли праймеры в соотношении:  прямой праймер:обратный праймер – 1:50.

            Далее проводили 45 циклов амплификации в автоматическом термоциклере.

            Увеличение количества циклов связано с тем, что первые 10-15 циклов идет наработка обычного двуцепочечного продукта (накопление продукта по экспоненте), а последующие 30-35 циклов после исчерпания прямого праймера нарабатывается одноцепочечный продукт (наработка продукта по линейной зависимости).

            Полученную ДНК  после амплификации отбирали в количестве 10 мкл и проводили электрофорез в агарозном геле. Результаты представлены на рис.7. 
 

 Дорожки:                                             1                 2                   3                        

                               

Рис. 7. Получение одноцепочечной ДНК.

Дорожки: 1 – ″-″-цепь;  2 – отрицательный контроль. 

            На  Рис.7 после  электрофореза  наблюдаем сигнал соответствующий двуцепочечному продукту, одноцепочечный продукт обычно не бывает виден.

            2. Гибридизация на мембране (дот-блот).

            Линовали  нитроцеллюлозную мембрану на 6 квадратов.

            На 4 квадрата в центр каждого наносили смесь ДНК (″-″ -цепь) с SSPE (1:1) по 4 мкл, в центры 2-х других квадратов наносили зонд в качестве положительного контроля. Высушивали в течение часа на воздухе в течение часа, потом ДНК пришивали к мембране при УФ в течение 5 минут.

            Мембрану переносили в раствор PBS-T + 1% БСА и выдерживали 15 минут.

            Дальше на первый квадрат вносили зонд 1-1, во второй – зонд 1-2, в третий – зонд 1-3, в  четвертый – зонд 1-4. Проводили  предгибридизацию и гибридизацию по выше описанной методике.

            В результате работы было показано, что плохо отмываются не полностью комплементарные зонды. И получающийся сигнал практически не отличается от сигнала в ячейках с полностью комплементарными зондами. А также работа по этой методике более трудоемкая, чем гибридизация на полистиролровых планшетах и фиксировать результат кроме как визуально невозможно, что может дать недостоверные данные.

              3.Гибридизация на полистироловых планшетах.

            3.1. Подбор зондов.

            Были рассчитаны и синтезированы 12 биотинилированных зондов к трем мутациям, которые вызывают резистентность к АРВ-препаратам, находящимся в амплифицированном участке (Таблица 4). Зонды подбирались таким образом, чтобы «ошибок» при сравнении последовательностей консенсусов и последовательности зонда не было. А место, где происходит мутация, в консенсусной последовательности было как можно более консервативным, т.е. чтобы данный нуклеотид встречался у большинства изолятов. 

Таблица 4. Последовательности зондов, к каким АРВ-препаратам устойчивость и номер позиции мутации.

            Выделенная буква  обозначает место мутации. Каждый первый зонд в группе является комплементарным к «дикому» типу.  
 
 
 

            3.2. Определение оптимальной концентрации конъюгата, оптимального количества зондов и оптимального количества ПЦР-продукта для постановки гибридизации.

            Для проведения гибридизации необходимо с помощью ПЦР наработать ПЦР-продукт (матрица) и зонд. В качестве зонда нарабатывали тот же участок генома, что и для ПЦР-продукта, но используя биотинилированные трифосфаты.

            Для получения ПЦР-продукта и зонда ставили реакцию амплификации. В качестве ДНК использовали плазмиду pBH10, содержащую полноразмерный геном ВИЧ. Проводили амплификацию в течение 35 циклов. 

            3.2.1. Определения оптимальной концентрации конъюгата.

            Проводили сорбцию ПЦР-продукта в количестве 0,15 пмоль/мкл по вышеописанной методике.

            После сорбции проводили гибридизацию, используя в качестве зонда биотинилированный ПЦР-продукт. При проведении реакции с конъюгатом в 5 лунках делали 10-кратные разведения следующим образом: в лунки вносили по 100 мкл конъюгатного буфера, кроме 1-ой. В 1-ую лунку вносили конъюгат в количестве 110 мкл с концентрацией 0,01 мг/мл, из неё отбирали 10 мкл и вносили во 2-ую лунку, перемешивали; отбирали 10 мкл из 2-ой лунки и переносили в 3-ью лунку и т.д. В 7 лунке ставили отрицательный контроль. Таким образом, получали разведения: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10⁴. Кроме этого для более точного определения оптимальной концентрации конъюгата был проведен опыт с засорбированной неспецифической ДНК. 

            После учета результатов были получены следующие данные:

 
 
 
 

            Данные обработаны с помощью «Excel»:

    

График 1. Выбор оптимальной концентрации конъюгата. Ряд 1 – ПЦР-продукт; ряд 2 – неспецифическая ДНК; ряд 3 – критической значение оптической плотности. 

            Из полученных данных следует: оптимальная концентрация конъюгата составляет 1*10^-5мг/мл. Критическое значение оптической плотности для отрицательного контроля приняли ≤0,2. А при разведении конъюгата 1:1000 наблюдаем максимальный сигнал при минимальном неспецифическом связывании. 

            3.2.2. Определение оптимального количества зонда.

            В 6 лунках сорбировали по методике разное количество зондов с концентрацией 50 пмоль/мкл: в 1-ой лунке – 5 мкл, во 2-ой – 10 мкл, в 3-ей – 20 мкл, в 4-ой – 40 мкл, в 5-ой – 80 мкл, в 6-ой – 160 мкл. В 8-ой лунке отрицательный контроль.

            После сорбции проводили реакцию с конъюгатом в течение часа при 37°C, дальше проявляли и останавливали реакцию. 
 
 
 
 
 
 

            После учета результатов были получены следующие данные:

 

          Данные обработаны с помощью «Excel»:  

         

График 2. Выбор оптимального количества зондов. 

            Из полученных данных следует: что даже при минимальном  количестве зондов наблюдаем хороший сигнал. Поэтому в дальнейших опытах для гибридизации добавляли зонды с концентрцией 250 пмоль в лунке.