"justify">            11. Готовили раствор для гибридизации.

            Из расчета V_общ.=100 мл, добавить:

            - буфер [×6] SSC                             – 30 мл;

            - ЭДТА, 0,5М                                   – 2 мл;

            - зонд, 40 пмоль/мл                         – 50 мкл;

            - р-р Денхардта  [×50]                     – 10 мл;

            - SDS, 10 %                                       – 5 мл;

            - ДНК неспецифическая, 10 мг/мл – 1 мл.

            12. Инкубировали в  водяной бане при температуре,  соответствующей температуре плавления  зондов, в течение 1 часа.

            13. Сливали, заливали раствор SSC [×2] и 0,5% SDS, оставляли на 5 минут.

            14. Сливали, заливали  раствор SSC [×2] и 0,1% SDS, оставляли на 15 минут при комнатной температуре, периодически помешивая.

            15. Сливали, заливали  раствор SSC [×0,1] и 0,5% SDS, инкубировали при Т=Т_{пл.зондов} – 12°C, слегка покачивая в течение 5 минут. (повторяли процедуру дважды).

            16. Заливали конъюгат  с разведением 1:50, оставляли на 1 час при комнатной температуре.

            17. Проявляли субстратом.

            18. Визуально оценивали  степень интенсивность сигнала  на мембране.

            5. Гибридизация в полистироловых планшетах.

 

            5.1. Общие сведения.

            Если водный раствор  ДНК нагреть до 100^оС или повысить рН до 13, то ДНК диссоциирует на 2 цепи (денатурирует), так как комплементарные связи между основаниями разрушаются. В 1961 году было обнаружено, что этот процесс обратим: выдерживание ДНК при температуре 65^оС вело к восстановлению структуры двойной спирали. Этот процесс называется ренатурация или гибридизация. Процессы гибридизации происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементарны: ДНК - ДНК, РНК - РНК, ДНК - РНК.

            Для теста необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный той последовательности, которую хотим обнаружить. Этот фрагмент получают либо клонированием, либо путем  химического синтеза. Одноцепочечная ДНК, используемая в качестве индикатора, называется ДНК-зонд. Она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов.

            ДНК-зонды применяются  в различных целях. Гибридизация ДНК-зонда с РНК, выделенной из анализируемой  клетки, может выявить наличие  или отсутствие экспрессии гена. Если гибридизации не происходит, значит ген молчит, не работает. ДНК-зонды также позволяют проводить диагностику наследственных болезней. 

            5.2. Реактивы.

            1. Раствор для  сорбции;

            2. 3М NaCl;

            3. Гибридизационный  буфер;

            4. Отмывочный раствор;

            5. Конъюгат с концентрацией  1*10^-4 мг/мл;

            6. Конъюгатный буфер;

            7. Субстрат ТМБ;

            8. STOP-раствор. 

            Приготовление раствора для сорбции:

            Смешать 2,5 мл 0,2М  раствора NaH₂PO₄ и Na₂HPO₄ и 1мл 0,5М ЭДТА. 

            Приготовление гибридизационного  буфера:

            Формамид 50% - 25 мл;

            NaCl, 5М – 7,5 мл;

            Na-фосфат, 5мМ, pH 7,0 – 1,25 мл;

            Твин-20, 0,1% - 0,05 мл;

            ЭДТА, pH 8,0, 0,5М – 0,5 мл;

            ДНК-осадитель (неспецифическая  ДНК из селезенки теленка), 50 мкг/мл – 0,25 мл. 

            - дозатор пипеточный с переменным объемом на 20мкл и на 200мкл;

            -  наконечники к дозаторам одноразовые с фильтрами;

            -  микропробирки  полипропиленовые вместимостью 0,5 мл;

            -  96-луночные стрипованые полистироловые планшеты для ИФА;

            -  термостат твердотельный  «Термит»;

            -  суховоздушный  термостат, 37°С. 
 
 

            5.3. Проведение сорбции и гибридизации.

            Сорбция.

            1. ПЦР-продукт в  количестве 100 нг (примерно 0,03пмоль)  расплавляли в 10 мкл воды при 95°С в течение 10 мин, сразу переносили в лед.

            2. Во все лунки вносили по 50 мкл раствора для сорбции и по 50 мкл 3М NaCl.

            3. Расплавленный ПЦР-продукт вносили в лунки.

            4. Для отрицательного контроля расплавляли 2 мкл неспецифической ДНК в 10 мкл воды при 95°С в течение 10 минут, сразу переносили в лед. Затем в количестве    12 мкл вносили в лунку.

            5. Ставили на ночь при 37°C в термостат. 

            Гибридизация.

            1. После сорбции  сливали со стрипов сорбционный раствор и промывали     1 раз отмывочным раствором. 

            2. Во все лунки  вносили по 100 мкл гибридизационного буфера, выдерживали 15 мин при комнатной температуре, чтобы произошла забивка, а потом раскапывали по 5 мкл зондов.

            3. Ставили на 1 час при 37°C в термостат.

            4. Сливали, промывали 3 раза отмывочным раствором.

            5. Разводили конъюгат: 1мкл конъюгата (с концентрацией 1мг/мл) в 100 мкл конъюгатного буфера. Полученный раствор разводили ещё в соотношении 1:100 в конъгатном буфере.

            6. Вносили во все лунки по 100 мкл конъюгата и ставили на 20 мин при 37°C в термостат.

            7. Сливали, промывали 3 раза отмывочным раствором.

            8. Вносили по 100 мкл субстрата ТМБ, ставили в темное место до развития окраски.

            9. Останавливали реакцию добавлением 100 мкл STOP раствора.

            10. Снимали показания интенсивности сигнала на планшетном фотометре. 

Экспериментальная часть.

            1. Получение фрагмента гена ВИЧ pol методом ПЦР.

            1.1. Подбор праймеров.

            Были взяты усредненные последовательности (консенсусные) по всем субтипам ВИЧ-1, которые в свою очередь выровнены относительно консенсуса из консенсусов. По этим последовательностям были подобраны праймеры (Табл.3) так, чтобы они амплифицировали участок нужной длины, где находятся исследуемые точечные мутации.

            Праймер прямой     5’- CCAAAGGTTAAACAATGGC -3’ (2604-2623)

            Праймер обратный 5’-TTTAGATTCTTAAATGGCTCC-3’(3578-3599) 

Таблица 3. Характеристики праймеров.

 
 

            1.2. Определение оптимальной концентрации плазмиды и определение количества нараработанного фрагмента.

            В качестве ДНК использовали плазмиду pBH10, содержащую полноразмерный геном ВИЧ. Плазмида с концентрацией 3 мг/мл в TE буфере.

             Отдельно делали разведение ДНК: в 4 пробирки добавляли по 10 мкл воды, потом в 1-ую пробирку добавляли 1 мкл ДНК,  перемешивали и из этой же пробирки отбирали 1 мкл раствора и переносили во 2-ую пробирку, перемешивали, отбирали 1 мкл раствора и переносили в 3-ью пробирку, здесь же опять перемешивали, отбирали 1 мкл раствора и переносила в последнюю – 4-ую – пробирку. Данные разведения наносили до проведения ПЦР и наблюдали наиболее интенсивный сигнал в разведении 1:10, что соответствует концентрации плазмиды 0,3 мг/мл.

            Далее полученные разведения добавляли по 1 мкл в ранее приготовленные пробирки со смесью для ПЦР. В 6-ую пробирку не добавляли ДНК, и, начиная с наименьшей концентрации ДНК (т.е. с последнего разведения) добавляли в 5,4,3,2 пробирки, соответственно. В 1-ую пробирку добавляли неразбавленную ДНК.

            Далее проводили 35 циклов амплификации в автоматическом термоциклере. 

            Полученную ДНК  после амплификации отбирали в количестве 10 мкл и смешивали с 1 мкл красителя бромфеноловый синий, и проводили электрофорез в агарозном геле. Результаты представлены на рис.4. 

  Дорожки:                  1                     2                    3                     4                   5                    6  

       

Рис. 4: Определение оптимальной  концентрации плазмиды.

Дорожки: 1 – отрицательный  контроль, 2 – разведение 1:10000, 3 – разведение 1:1000, 4 – разведение 1:100, 5 – разведение 1:10, 6 – ДНК с исходной концентрацией 3 мг/мл. 

            На  Рис.4 после электрофореза  наблюдаем, что на первой дорожке ничего нет – так как в этой пробирке не было ДНК. Дальше, начиная со 2-ой до 5-ой дорожки идет увеличение интенсивности свечения  – это означает, что концентрация ДНК увеличивается. На последней дорожке сигнал отсутствует из-за того, что происходит ингибирование реакции большим содержанием матрицы и/или высокой концентрацией ЭДТА в растворе, содержащим плазмиду.

            Из полученных данных видно, что самое интенсивное  свечение наблюдается при разведении ДНК 1:10, которое и использовалось в дальнейшей работе. Количество ПЦР-продукта составляет примерно 0,15 пмоль/мкл. 
 
 
 

            1.3. Определение оптимальной температуры отжига праймеров и их оптимальной концентрации.

            Для постановки ПЦР  и наработки материала для  проведения гибридизации необходимо подобрать оптимальные условия для максимального выхода продукта нужной длины. С помощью ПЦР и электрофореза в агарозном геле определяли оптимальные:

            1. –   температуру отжига праймеров;

             2. – концентрацию праймеров;

             3. –  концентрацию ионов магния в смеси. 

            I.3.1. Определение оптимальной температуры отжига праймеров.

            Ставили градиентную ПЦР в 5 пробирках, в интервале температур от 40 до 56,6°С с шагом  ~4°С; 35 циклов в градиентном амплификаторе.

             После проведения ПЦР и электрофореза в агарозном геле оптимальной температурой отжига праймеров оказалась 48,6°С.

            I.3.2. Определение оптимальной  концентрации праймеров.