Автор: Пользователь скрыл имя, 01 Ноября 2011 в 12:22, курсовая работа
Цель работы: изучить возможность создания биочипов для выявления точечных мутаций в геноме ВИЧ-1 в полистироловых планшетах.
Задачи исследования:
1. Выбрать участок гена ВИЧ-1, в котором находятся несколько мутаций, которые являются первичными, перекрестными у нескольких АРВ-препаратов и встречаются в наиболее консервативных участках генома;
2. подобрать праймеры для амплификации выбранного участка гена;
3. рассчитать и синтезировать зонды для выявления выбранных мутаций;
4. определить оптимальные условия проведения ПЦР;
5. отработать и сравнить методики гибридизации на полистироловых планшетах и на нитроцеллюлозной мембране (дот-блот).
Введение. 2
Актуальность проблемы. 2
Обзор литературы. 4
История открытия ВИЧ. 4
Таксономическое положение и генетическое разнообразие ВИЧ. 5
Строение ВИЧ. 7
Характеристика генома ВИЧ. 8
Патогенез ВИЧ-инфекции. 11
Диагностика ВИЧ. 14
Лечение ВИЧ-инфекции. 20
Резистентность к АРВ-препаратам. 22
Методы выявления мутаций, приводящих к формированию резистентности: секвенирование, биочипы. 24
История создания биочипов 27
Технология биочипов 27
Принцип работы биочипов. 28
Разновидности биочипов, методики создания биочипов, достоинства и недостатки различных видов биочипов. 29
Материалы и методы. 32
1. Полимеразная цепная реакция. 32
2. Электрофорез в агарозном геле. 34
3. Осаждение ДНК этанолом. 36
4. Гибридизация на мембране (дот-блот). 37
5.. Гибридизация в полистироловых планшетах 38
Экспериментальная часть. 41
I. Получение фрагмента гена ВИЧ pol методом ПЦР. 41
II. Гибридизация с биотинилированными зондами на мембране (дот-блот). 46
III.Гибридизация с биотинилированными зондами на полистироловых планшетах. 47
Выводы. 54
Список литературы. 55
34. Perelson, A. S., Essunger, P., Cao, Y. et al. Decay characteristics of HIV-1-infected compartments during combination therapy. Nature 387:6629 (1997), 188–91.
35. Piatak M Jr, Saag MS, Yang LC. Et al. High levels of HIV-1 in plasma during all stages of infection determined by competitive PCR. Science. 1993, 259:1749-54.
36. Reinis, M., Vandasova, J., Stankova, M., Linka, M. & Bruckova, M. Human immunodeficiency virus 1 strains resistant to nucleoside inhibitors of reverse transcriptase in isolates from the Czech Republic as monitored by line probe assay and nucleotide sequencing. Acta Virol. 45:5–6 (2001), 279–86.
37. Sato, H., Orenstein, J., Dimitrov, D. & Martin, M. Cell-to-cell spread of HIV-1 occurs within minutes and may not involve the participation of virus particles. Virology 186:2 (1992), 712–24.
38. Schmit, J. C., Ruiz, L., Stuyver, L. et al. Comparison of the LiPA HIV-1RT test, selective PCR and direct solid phase sequencing for the detection of HIV-1 drug resistance mutations. J. Virol. Methods 73:1 (1998), 77–82.
39. Schutten M, van den Hoogen B, van der Ende ME. Development of a real-time quantitative RT-PCR for the detection of HIV RNA in plasma.
40. Sturmer, M., Morgenstern, B., Staszewski, S. & Doerr, H. W. Evaluation of the LiPA HIV-1 RT assay version 1: comparison of sequence and hybridization based genotyping systems. J.Clin. Virol. 25 (Suppl. 3) (2002), 65–72.
41. Vartanian, J. P., Sala, M., Henry, M., Wain-Hobson, S. & Meyerhans, A. Manganese cations increase the mutation rate of human immunodeficiency virus type 1 ex vivo. J.Gen. Virol. 80:8 (1999), 1983–6.
42. Wu
L, KewalRamani VN. Dendritic-cell interactions with
HIV: infection and viral dissemination. Nat
Rev Immunol. 2006,
6:859-68.