Наиболее широкое  распространение приобрел метод  иммуноферментного анализа (ИФА). 

1). Серологический метод.

            Серологический метод  диагностики применяется с 1985 года.

            В течение ВИЧ-инфекции выделяют стадию сероконверсии, характеризующуюся  появлением в крови пациента антител  к ВИЧ, выявляемых стандартными серологическими  методами. Сероконверсия начинается с IgM-ответа (появление антител класса IgM), который накладывается на период виремии (viraemia - наличие вирусов в крови). Вслед за IgM в течение 5-7 дней появляются IgG-антитела, специфичные к р24 и gp120. Титры IgG-антител продолжают увеличиваться в течение первых нескольких месяцев, после чего стабилизируются. Титр антител к р24 может уменьшаться при увеличении титра антигена р24.

            Антитела к ВИЧ  могут быть обнаружены в течение 2-8 недель после заражения. 

            Промежуток времени  между моментом заражения и сероконверсией называют сероконверсионным или  серонегативным окном.

            Для подтверждения  диагноза ВИЧ-инфекции серологическим методом, сыворотки сначала тестируют  на предмет обнаружения ВИЧ-специфических  антител методом ИФА.

            В случае обнаружения  положительного результата или результата в пограничной зоне, проводят дополнительные подтверждающие исследования. Тестируемый вновь должен сдать кровь для исследования ещё одного образца крови с использованием того же метода выявления антител. Обе положительные сыворотки в дальнейшем тестируют с помощью ИФА с другими антигенами ВИЧ и исследуют методом иммунного блотинга.

            Первые недели после  инфицирования антитела к ВИЧ  не выявляются. Поэтому отрицательный  результат тестирования на ВИЧ в  этот период не означает, что человек  не инфицирован ВИЧ и не может  заразить других [11].

            В настоящее время выпускают ИФА тест-системы 4-го поколения (см. табл.1), которые позволяют объединить в одном исследовании определение антител к ВИЧ и вирусного антигена (р24) [11]. В комплект входят реактивы для обнаружения антител и антигенов ВИЧ-1, ВИЧ-1 группы О и ВИЧ-2.  

Таблица 1. Характеристика тест систем для постановки твердофазного ИФА, применяемых при  лабораторной диагностике  ВИЧ-инфекции.

 

            Включение с 1994 г. в состав ИФА-наборов антигенов ВИЧ-1 группы О увеличило чувствительность исследования, хотя все еще остается вероятность ложноотрицательных результатов при заражении этой группой вируса ввиду гетерогенности штаммов вируса внутри подтипа [22].

            Причины ложноотрицательных результатов:

              • период серонегативного окна;

              • административная  ошибка (неправильная маркировка  образца или бланка);

              • первичная  инфекция у иммунодефицитных  больных;

              • серореверсия, наблюдается на поздних стадиях   заболевания, иногда на фоне  противоретровирусной терапии;

              • штаммы группы  N и О или ВИЧ-2. 

            Причины ложноположительных результатов:

              • административная  ошибка;

              • вакцинация  против ВИЧ;

              • гемодиализ;

              • аутоиммунная  патология;

              • наличие  антител к аутоантигенам HLA класса II;

              • множественная  миелома;

              • гемофилия;

              • алкогольный  гепатит;

              • болезни  печени;

              • вакцинация  против гриппа и бешенства;

              • заболевания,  вызванные другими ретровирусами.

            Для скрининговых исследования доступны также методы ускоренной диагностики.

            Они выполняются  в течение нескольких минут и требуют минимальный набор лабораторного оборудования, что очень удобно при небольшом потоке исследования.

 

            Подтверждающие  тесты.

            В качестве подтверждающего  теста во всем мире используется иммунный блотинг (иммуноблот, ИБ). Это вариант иммуноферментного анализа, при котором определяются антитела к антигенам ВИЧ, предварительно разделенных по молекулярному весу с помощью электрофореза на нитроцеллюлозной мембране. При постановке реакции линии (полосы) антигенов, к которым обнаруживаются антитела, окрашиваются. Иммуноблот позволяет обнаружить антитела к белкам ВИЧ-1, в том числе белкам сердцевины вируса (р17, р24, р55), гликопротеинам оболочки (gp41, gp120, gp160) и ферментам (p32, р66).

            Положительным результатом считается одновременное обнаружение любых двух полос, соответствующие вирусным белкам и полосы, принадлежащей гликопротеинам.

            Отрицательный результат – отсутствие всех полос.

            Наличие любых полос, сочетание которых не удовлетворяет  критериям положительного результата, учитывается как неопределенный результат.

            В первом поколении  ИБ использовался вирусный лизат. В таком варианте ИБ уступал по чувствительности ИФА и выявлял перекрестно реагирующие антитела. Использование рекомбинатных антигенов значительно повысило чувствительность и специфичность ИБ и позволило проводить дифференциацию между антителами, специфичными к ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Однако, даже в таком случае, при постановке ИБ высока вероятность обнаружения неопределенного варианта ответа. Неопределенные результаты ИБ наблюдаются у лиц с аутоиммунной патологией, особенно системной красной волчанкой, при герпетической инфекции, вызываемой вирусами герпеса 1-го типа, цитомегаловирусной инфекции, после прививки против гриппа и бешенства.  

            2). Выявление генетического материала ВИЧ.

            Обнаружение ДНК или РНК ВИЧ с помощью реакций, основанных на амплификации нуклеиновых кислот (НК) – высокочувствительный и специфический метод прямого обнаружения возбудителя.

            Выявление провирусной ДНК  ВИЧ.

            Провирусная ДНК  ВИЧ может быть обнаружена в лимфоцитах периферической крови с помощью ПЦР – амплификации коротких фрагментов определенной области вирусного генома, координаты которой определяются подбором праймеров [35]. Например, один из первых наборов «Amplicor assay» фирмы Roche Molecular выявляет короткий фрагмент гена gag (чувствительность 95%). Ложноотрицательные результаты возможны из-за изменения нуклеотидной последовательности искомой области вируса, низкого числа копий провирусной ДНК в исследуемом материале, неправильного забора материала.

            Однако разработчики наборов должны обязательно учитывать, что ПЦР, оптимизированная для обнаружения ДНК ВИЧ-1 группы М, может не амплифицировать ДНК ВИЧ-1 группы О [8]. В связи с этим, наборы для постановки ПЦР в обязательном порядке должны содержать праймеры, специфичные для ВИЧ-1 группы О.           

            ПЦР применяется  для выявления ДНК ВИЧ уже более десяти лет и имеет высокую аналитическую чувствительность. Использование этого метода обосновано при обследовании детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, пациентов в периоде «серонегативного окна», при наличии эпидемиологических критериев, свидетельствующих о недавнем риске заражения ВИЧ; у лиц с предположительно ложноположительным или ложноотрицательным результатом ИФА и ИБ.  

            Особо необходимо отметить значение ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции у детей первого года жизни. Ранняя диагностика ВИЧ-инфекции у детей этого возраста в принципе невозможна без применения ПЦР. Это обусловлено тем, что ребёнок, родившийся от ВИЧ-инфицированной матери имеет материнские антитела к вирусу иммунодефицита. Различить материнские и собственные антитела к ВИЧ не представляется возможным. У неинфицированного ребёнка данные антитела элиминируются под влиянием собственной иммунной системой к возрасту 6-9 месяцев, хотя в отдельных случаях могут циркулировать до 18 месяцев жизни.

            Таким образом, ПЦР  позволяет проводить дифференциальную диагностику ВИЧ-статуса у детей  раннего возраста. Так, если имеет  место положительный результат  ПЦР на НК вируса иммунодефицита в  первые 48 часов жизни, то ВИЧ-инфицирование произошло in utero. Если имеет место отрицательный результат ПЦР в первые 48 часов, но становится положительным в возрасте 7 – 14 дней жизни, то инфицирование произошло intrapartum.

            Таким образом, в  настоящее время метод ПЦР  является основным лабораторным критерием диагностики. 
 

            Обнаружение и определение  количества РНК ВИЧ-1.

            Методы определения  РНК ВИЧ используются в качестве диагностического критерия, дополняющего классическое серологическое тестирование на ранних стадиях ВИЧ-инфекции и  при обследовании новорожденных у зараженных матерей. Количественный метод определения РНК ВИЧ (показатель вирусной нагрузки) используется для диагностики острой ВИЧ-инфекции, прогноза вероятности передачи вируса, прогноза темпа прогрессирования ВИЧ-инфекции, выявления показаний к началу атиретровирусной терапии, а также для наблюдения за эффективностью лечения.

             

             При острой  ВИЧ-инфекции в большинстве случаев  определяется высокая концентрация  РНК вируса (10⁵-10⁶ копий/мл). У 2-9% людей, не инфицированных ВИЧ, исследования дают ложноположительные результаты, практически всегда показывая низкую концентрацию РНК ВИЧ (менее 10⁴ копий/мл).

            При постановке тестов на РНК в качестве материала для  исследования должна быть использована плазма крови с ЭДТА, так как  РНК, в отличие от ДНК, очень быстро разрушается под действием нуклеаз, что приводит к резкому снижению титра РНК вируса в образце. Плазма должна быть заморожена не позднее 8 часов после забора материала. В присутствии ЭДТА образец может быть подвергнут замораживанию/оттаиванию не более 3-х раз, в противном случае происходит резкое падение титра РНК ВИЧ [39].

            Наибольшее распространение  получили тест-системы, в основе которых  лежит ПЦР с детекцией продуктов  амплификации путем твердофазной гибридизации и анализа гибридизационного комплекса ферментным или флуоресцентным методом, а также ПЦР в режиме реального времени (Real-time PCR). В ходе выполнения ПЦР в режиме реального времени детекция продуктов ПЦР осуществляется с помощью специального прибора, регистрирующего изменения флуоресцентно сигнала. Кинетика накопления продуктов амплификации зависит от исходного количества матрицы, что позволяет оценить количество исходного продукта, т.е. вирусную нагрузку. 
 

            3). Культуральное исследование.

            При культивировании мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из крови ВИЧ-инфицированных с мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров, в присутствии интерлейкина-2, через 7-10 дней можно идентифицировать положительную на присутствие ВИЧ культуру клеток. Для заключния об отрицательном результате требуется 4-5 недель. Идентификацию ВИЧ-инфекции в культуре клеток осуществляют с помощью различных вирусологических методов. При световой микроскопии в типичных случаях отмечают появление цитопатиеского эффекта и образования синцитий (гигантских конгломератов слившихся клеток).