Пример  секвенирования. 

            Реакционная смесь  для секвенирования содержит терминирующие нуклеотиды, меченные флуорофором, ДНК полимеразу, праймер для секвенирования. Для каждого исследуемого образца ставится несколько реакций секвенирования, в зависимости от количества и длины получаемых в ПЦР продуктов амплификации. Для длинных фрагментов необходимо поставить несколько реакций секвенирования с разными затравочными праймерами.

            Принцип циклического секвенирования основан на встраивании  цветных флуоресцентных меток в  растущую цепь ДНК за счет терминирующих  нуклеотидов. Каждый из четырех терминирующих  нуклеотидов содержит метку, флуоресцирующую определенным цветом. Растущая цепь одновременно терминируется и метится в момент присоединения нуклеотидов. В ходе такого процесса образуется каскад последовательностей ДНК, причем каждый синтезированный ДНК-продукт на одно основание длиннее последующего.

            Полученный продукт реакции секвенирования подвергается очистке от не включенных нуклеотидов с флуорофорами. Для этого используется методика двукратного осаждения 70 - 75% раствором изопропанола.

            Автоматическая  детекция продуктов.

            Автоматическая детекция продуктов реакции секвенирования осуществляется в капиллярных секвенаторах, рекомендуемых производителем тест-системы. В процессе детекции отрицательно заряженные фрагменты каскадной ДНК, полученной в ходе циклического секвенирования, мигрируют в полиакриламидном геле или полимере в капилляре под действием электрического поля. При этом фрагменты малого размера мигрируют быстрее крупных. Каждый фрагмент возбуждается аргоновым лазером, сигнал флуоресценции детектируется CCD-камерой. Дальнейший сбор и преобразование данных осуществляется автоматически.

            Интерпретация результатов.

            Для интерпретации  результатов секвенирования ДНК  используются запатентованные программы, прилагаемые к тест-системам. Кроме  того, анализ результатов может быть осуществлен с помощью специализированных программ, находящихся в свободном доступе в Интернете (например, на сайте Госпиталя Стенфордского Университета, http://hivdb6.stanford.edu). Как правило, результаты представлены в таком виде, что для каждого препарата из группы ингибиторов протеазы и обратной транскриптазы определена степень устойчивости ВИЧ. Вирус может быть чувствителен к препарату либо иметь высокую, среднюю или низкую степень устойчивости. По этим данным врач принимает решение о необходимости изменения схемы терапии.

            Можно выявить определенные изменения в геноме ВИЧ, не проводя  секвенирования больших участков генов  протеазы или ОТ. В настоящее время  исследуются возможности применения разных технологий для обнаружения  отдельных мутаций в геноме ВИЧ, в том числе методов гибридизации с линейными зондами (LIPA),

олигонуклеотидных биологических микрочипов (GeneChip производства компании Affymetrix), методик ПЦР-диагностики отдельных мутаций, а также методов, основанных на лигировании синтетических олигонуклеотидных зондов (OLA). В этих методиках используются зонды, способные выявить точечные мутации. Методики, выявляющие точечные мутации, могут быть более чувствительны по сравнению с обычным секвенированием или фенотипированием в отношении выявления резистентных штаммов ВИЧ, присутствующих в организме пациента в небольшом количестве [38], однако свойственная вирусу вариабельность нуклеотидных последовательностей вблизи искомой мутации резистентности может стать значимым препятствием для гибридизации [36, 40].

            История создания биочипов.

            О возможности создания биочипов российские учёные заявили одними из первых в мире. В конце 80-х годов прошлого века в Институте молекулярной биологии (ИМБ) РАН им. В. А. Энгельгардта коллектив под руководством академика Андрея Мирзабекова разработал технологию микроматриц, или биочипов, как их стали называть позднее. Революционность новой методики заключалась в том, что она позволила значительно сократить продолжительность сложных лабораторных анализов биологических материалов за счёт параллельной многопараметрической обработки образцов — от шести-восьми недель до одного дня.

            Технология  биочипов.

            Биологические микрочипы (biochips) или, как их чаще называют — DNA microarrays, — это один из новейших инструментов биологии и медицины 21 века. Биочипы используются для самых разных целей.

            Исследователи в  университетах и в фармакологических фирмах проводят на чипах одновременный анализ работы тысяч и десятков тысяч генов и сравнивают экспрессию этих генов в здоровых и в раковых клетках. Такие исследования помогают создавать новые лекарственные препараты и быстро выяснять, на какие гены и каким образом эти новые лекарства действуют. Биочипы являются также незаменимым инструментом для биологов, которые могут сразу, за один эксперимент, увидеть влияние различных факторов (лекарств, белков, питания) на работу десятков тысяч генов.

            Принцип работы.

            Обычно для  выявления или количественного  анализа какого-либо вещества в окружающей среде или биологическом материале, полученном от пациента, проводят реакцию  с реактивом, специфически взаимодействующим  с этим веществом. В результате такой реакции образуется вещество с новыми физическими или химическими свойствами, количество которого определяют с помощью анализатора. В случае если образующееся вещество обладает цветом или может светиться под действием возбуждающего света, обнаружение и количественный анализ образовавшегося продукта определяют с помощью спектрофотометров или флуориметров. По количеству образовавшегося продукта судят о наличии и содержании в анализируемом образце того или иного вещества. 
                     По такому же принципу работает и биологический микрочип. Он представляет собой твердую подложку с небольшими ячейками. В каждой ячейке иммобилизовано (закреплено) собственное вещество-реагент, которое служит зондом (щупом, пробой) для проведения той или иной реакции. Все реагенты расположены в определенном порядке и взаимодействуют с анализируемым образцом как ключи с замком. В том месте чипа, где есть соответствие (комплементарность) между молекулами исследуемого вещества и молекулами зонда, образуется новый продукт – дуплекс, который и определяется анализирующим оборудованием. Картина распределения ячеек биочипа, содержащих дуплексы, является индивидуальной характеристикой анализируемого образца. 
 

            Разновидности биочипов, методики создания биочипов, достоинства и недостатки различных видов биочипов.

            Сейчас уже  десятки компаний выпускают различные  типы чипов, отличающиеся друг от друга  по методике изготовления и методу, с помощью которого регистрируют результат взаимодействия чипа с  образцом. 
Существуют биочипы, изготавливаемые методом синтеза зондов непосредственно на подложке. Плотность ячеек в таком чипе очень высока: на площади 1 мм² может быть расположено более тысячи ячеек, а весь чип содержит миллионы ячеек. Такие биочипы предназначены для анализа крупных фрагментов ДНК, иногда для анализа всего генома организма. Стоимость таких чипов, как и анализирующего оборудования, очень высока, и лишь очень богатые страны могут позволить себе проводить анализы с помощью этой технологии.

            Например, чипы фирмы Affymetrix (США) наращиваются прямо из стеклянной пластинки методом фотолитографии с использованием специальных микромасок. Применение отработанных методов электронной промышленности позволило добиться впечатляющих результатов. На одном таком чипе расположены десятки (а иногда и сотни) тысяч пятен размером в несколько микрон. Каждое пятно — это один уникальный фрагмент ДНК длиной в десятки нуклеотидов.

            Изготовленный таким  образом биочип в дальнейшем гибридизуют  с молекулами ДНК, мечеными красителем. Сравнивают, например, ДНК, выделенную из здоровых клеток, и ДНК, выделенную из раковых клеток. Часто сравнивают ДНК, выделенную от разных больных. После гибридизации на биочипе возникают причудливые узоры. Эти узоры бывают разными у нормальных и у раковых клеток, они также сильно различаются при различных видах лейкозов. Излечимые виды лейкозов дают одни узоры (паттерны), неизлечимые дают совсем другие паттерны. По виду паттернов можно с большой вероятностью предсказать течение болезни на самой ранней ее стадии.

             
                    Принципиально другой тип чипов изготавливается путем нанесения раствора, содержащего зонд, на заранее подготовленную, «активированную» поверхность подложки. Такие «специализированные» чипы, имеющие гораздо меньшую плотность (на 1 мм² расположены десятки ячеек), предназначены для работы с ограниченными фрагментами ДНК. Стоимость таких биочипов гораздо меньше. 
                 

               По  технологии, разработанной под руководством  А.Д. Мирзабекова, зонды микрочипа  расположены в ячейках, состоящих  из геля. Объем каждой ячейки составляет примерно один нанолитр (миллионная доля литра). Биочип, содержащий трехмерные ячейки, обладает существенными преимуществами по сравнению со стандартными двумерными чипами. Взаимодействие исследуемых образцов с зондами, иммобилизованными в геле, имеет больше сходства с процессами, протекающими в растворе, чем в том случае, когда иммобилизованные зонды находятся на поверхности стекла, вследствие чего достигается высокая специфичность их взаимодействия с молекулами из анализируемого образца. Каждая ячейка содержит гораздо большее количество молекул зонда по сравнению с зондами, прикрепленными к двумерной поверхности. В водном окружении молекулы сохраняют свою активность, с ними можно проводить любую ферментативную реакцию. Трехмерные биочипы позволяют изучать кинетику и термодинамику реакций, протекающих в индивидуальных ячейках, в том числе образование дуплексов нуклеиновых кислот. 
                     Каждая ячейка отделена от соседних ячеек гидрофобной поверхностью, что позволяет осуществлять в ячейках трехмерных биочипов разнообразные реакции, в т. ч. полимеразную цепную реакцию с различными праймерами и др. 
В зависимости от того, какие молекулы содержатся в ячейках биочипа и служат в качестве зондов, он может быть применен для разных целей. Если в ячейках содержатся фрагменты ДНК, идентичные тем, которые имеются в геноме возбудителей инфекционных болезней, биочип может быть использован для обнаружения и идентификации этих возбудителей. Так, уже разработаны биочипы для выявления возбудителей туберкулеза, неонатальных инфекций, оспы, гриппа, гепатита, герпеса и ряда др. 
                     В качестве зондов можно использовать фрагменты ДНК с последовательностями, характерными при наследственных или обменных заболеваниях человека. В этом случае биочип может служить для обнаружения соответствующей болезни или для выявления предрасположенности к ней. Так, например, имеются чипы для выявления хромосомных мутаций при лейкозах, обнаружения предрасположенности к гипертонии, кардиологическим заболеваниям и т. д. 
                     Поскольку молекулы сохраняют свою активность внутри ячеек биочипа, существует возможность создания белковых биочипов, содержащих в качестве зондов антигены или антитела. Такие биочипы могут применяться для проведения иммунохимических анализов, например для количественного анализа свободных и связанных специфических антител, онкомаркеров, биологических токсинов. 
                     Еще одним важным достоинством трехмерных чипов является их высокая чувствительность, что позволяет использовать для регистрации результатов относительно простое оборудование и проводить сотни анализов в день. Эта технология предназначена для обследования больших групп населения с минимальными финансовыми затратами. 
Результат взаимодействия биочипа с исследуемым образцом регистрируют анализатором биочипов по интенсивности флуоресценции красителя, присоединенного к анализируемому веществу. Специализированная компьютерная программа автоматически обнаруживает контрольные ячейки биочипа и определяет правильность проведения анализа. Затем эта же программа определяет интенсивность всех ячеек биочипа и детектирует, в каких из них произошла специфическая реакция. На основании этих данных на мониторе компьютера появляется результат анализа в удобном для врача виде.

            Специалисты из Нортвестернского университета в США разработали  для американской армии биочип, обладающий совершенно неожиданными свойствами. Если на этот биочип попадает ДНК от патогенных микробов, то фрагменты  ДНК зондов с прикрепленными к  ним микроскопическими частицами золота выстраиваются в ряд. Между электродами идет ток и биочип сигнализирует об угрозе.

            Биочипы сегодня  — это быстро развивающийся рынок, где работают десятки фирм. Биочипы  – это основа биомедицины 21 века.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Материалы и методы.

            1. Полимеразная цепная  реакция.

            1.1. Общие сведения.

            Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR - polymerase chain reaction) является самым современным методом анализа ДНК, имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами диагностики.

                  Идея ПЦР основана на том, что ген или его фрагмент можно размножить в пробирке, увеличивая количество его копий в миллионы раз. Механизм ПЦР заключается в синтезе in vitro коротких нуклеотидных последовательностей для последующего анализа. Для проведения ПЦР нужны:

            • ДНК-матрица –  молекула ДНК или её часть, содержащая искомый фрагмент (это может быть всего одна – единственная молекула ДНК вируса или бактерии, оказавшаяся  в пробе для анализа);

            • праймеры (небольшие  фрагменты из 20-30 нуклеотидных пар), комплементарные последовательностям нуклеотидов на концах искомого фрагмента. Праймеры служат, по существу, для 2-х целей: во-первых, инициируют работу ДНК-полимеразы, предоставляя ей свободный 3′-конец; а во-вторых, ограничивают её действие, как бы ″застопоривают″ фермент в рамках выбранного для копирования участка ДНК, ограничивая его с двух сторон;

            • смесь трифосфатных нуклеотидов (являющихся материалом для  синтеза новых комплементарных  цепей ДНК); 

            • фермент ДНК-полимераза;

            • буферный раствор (реакционная среда содержащая ионы Mg²۫, необходимые для поддержания активности фермента).