Оценка токсикологических свойств продуктов растворения коллагена

В каждой колбе подсчитывали клетки водорослей, в двух камерах с последующим вычислением среднего арифметического.

Среднее число клеток в квадратах составило 192 штуки. Далее рассчитываем по формуле количество клеток в см³ по формуле (9):

млн. кл./см³

Таким образом, при исходной численности культуры водорослей 1,92 млн. кл./см³ в колбы на 100 см³ добавили по 0,8 см³ водорослевой суспензии.  

Процедура биотестирования и выполнение измерений при использовании прямого счета численности клеток водорослей. При определении острой токсичности водный вытяжки ПРК, в стеклянные плоскодонные колбы вместимостью 250 см³ наливали по 100 см³ контрольной (дистиллированной с рН 7,0 – 7,5). Повторность двукратная. Затем в каждую колбу пипеткой стерильно, над пламенем горелки добавляли по 0,1 см³ каждого концентрированного раствора реактивов в порядке расположения в таблице 1. Содержимое колб перемешивали. Затем во все колбы добавляли равные объемы суспензии водорослей. Таким образом, численность клеток в них составила 19 тыс. кл./см³. При исходной численности культуры водорослей 1,92 млн. кл./см³ во все колбы добавили по 0,8 см³ водорослевой суспензии, тогда численность клеток в каждой колбе составила 19 тыс. кл./см³. После внесения водорослей колбы вновь перемешивали.

Сразу после перемешивания производили подсчет клеток водорослей в камере Горяева во всех контрольных и испытуемых пробах. В каждой колбе дважды подсчитывали численность клеток. Содержимое колб вновь перемешивали, закрывали стерильными ватно-марлевыми пробками. Колбы встряхивали 1 - 2 раза в сутки, чтобы улучшить газообмен в исследуемых растворах.

Далее подсчитывали численности клеток в камере Горяева в контрольных и опытных колбах проводили через 96 часов от начала биотестирования. После 96-часовой экспозиции биотестирование заканчивали. Результаты измерений регистрировали в рабочем журнале (приложение В).

В таблице В.1 рассчитывали:

- фактическую повторяемость для 2-х повторностей в % вычисляли по следующей формуле (10):

<r,                                              (10)

- значение погрешности измерений, тыс. кл./см³ вычисляли по следующей формуле (11):

, при Р = 0,95,                                  (11)

2.2.6.1 Результаты биотестирования Scenedesmus quadricauda

При определении острой токсичности водных вытяжек их ПРК и их разбавлений устанавливали:

- острую токсичность или ингибирующую концентрацию (ИК50-96), ингибирующую кратность разбавления (ИКР50-96) водных вытяжек из ПРК, вызывавшую 50%-ное снижение численности клеток водорослей за 96-часовую экспозицию;

- безвредную концентрацию отдельных веществ (БК20-96), кратность разбавления водных вытяжек из ПРК, вызывающую не более чем 20%-ное снижение численности клеток водорослей за 96-часовую экспозицию – БКР20-96.

Об угнетении водорослей в опыте по сравнению с контролем судили по снижению численности клеток водорослей через 96 часов от начала биотестирования.

При определении острого токсического действия для каждого разведения по результатам двух параллельных определений вычисляли среднее значение численности клеток по формуле (12):

,                                                       (12)

Рассчитывали относительное (в %) изменение численности клеток водорослей для каждого разведения по сравнению с контролем (I):

,                                              (13)   

Характеристики степени токсичности испытуемой водной вытяжки из ПРК приведены в таблице 11.

Таблица 11 – Характеристики степени токсичности водной вытяжки из ПРК

Стимуляцию (противоположная угнетению реакция тест-объектов на воздействие токсикантов) до уровня 30% по сравнению с контролем считали как нетоксичное действие испытуемой воды на тест-объект. При стимуляции более 30% водная вытяжка из ПРК, признается токсичной.

Экспериментально не получили точного значения кратности разбавления, вызывающей 50%-ное ингибирование водорослей за 96 часовую экспозицию, поэтому для получения точного ИКР50-96 без выполнения дополнительных экспериментов, использовали расчетный метод определения.

Расчетный метод определения ИК50-96, ИКР50-96.

Десятичный логарифм концентрации исследуемых водных вытяжек из ПРК (lgC) обозначили х, а численные значения пробитов угнетения темпа роста водорослей – у. Учитывали только те значения lgC, при которых наблюдали подавление темпа роста водорослей. В результате испытаний получили n пар чисел по формуле (4), по которым определяли линейную зависимость по формуле (5).

Численные значения коэффициентов k и b вычисляли по формулам (6), (7).

Таблица 12 – Расчетная таблица

Продолжение таблицы 12