Оценка токсикологических свойств продуктов растворения коллагена

В Германии предложен способ, по которому овчины обрабатывают аналогичным составом. После обработки ферментным препаратом следует промывка для удаления неколлагеновых белков и обработка в течение 0,5 часов в 0,5%-ном растворе уксусной кислоты, после чего сырье помещают в 0,05М раствор уксусной кислоты.

Другой способ основан на обработке коллагенсодержащих отходов щелочным раствором, содержащим бикарбонат натрия, бактериальную протеазу (или панкреатин), натриевую соль глютаминовой кислоты и неионогенный ПАВ, рН = 7,5 - 8. Затем следует нейтрализация молочной кислотой до рН = 3,2.

В нашей стране предложен следующий способ получения ферментной дисперсии коллагена. Сырье механически измельчают, обрабатывают раствором хлорида натрия для удаления неколлагеновых белков (кроме гольевого спилка), промывают проточной водой. Затем сырье помещают в 0,04н раствор НСl с рН = 1,6, содержащий пепсин в количестве 1,5% от массы белка при температуре 27 ± 0,5°С и регулярно перемешивают. Дерма теленка после суточного гидролиза переходит в раствор на 95%, дерма КРС и гольевой спилок шкур КРС полностью растворяется после пятисуточного гидролиза. После частичного гидролиза проводят инактивацию фермента, в результате которой получается волокнистая коллагеновая масса, которую затем фильтруют.

Предложен способ получения дисперсий коллагена при обработке гольевой обрези протакрином и ренин - мезентерином.

Если щелочно-солевые растворы вызывают практически полное дезамидирование боковых цепей и разрушение кислых гликозаминогликанов, то после ферментативной обработки эти показатели фактически не изменяются по сравнению с исходной тканью. Небольшие изменения в содержании гексоз, оксипролина, общего азота и тирозина свидетельствуют о повышении степени очистки и удалении неколлагеновых примесей.

Применяемая для подготовки к растворению дерм ферментативная обработка, по сравнению со щелочно-солевой, вызывает значительно меньшие изменения химического состава, физико-химической стабильности, морфологической и электронно-микроскопической структуры. Однако она ведет к разрушению межмолекулярных связей, обусловлива полное растворение коллагена в слабых органических кислотах. Можно ожидать, что в раствор после ферментативной обработки переходят частицы, сохраняющие в большей степени свои молекулярные параметры, чем после щелочно-солевой. Для получения дисперсий коллагена можно использовать различные ферментные препараты, целесообразность их применения определяется «возрастом» коллагенсодержащих тканей. Однако во избежание деструкции коллагена, желательно обеспечить максимальное исключение из протеаз коллагеназ, чтобы получился нативный коллаген.

Характеристическая вязкость ФРК составляет 1,1 – 2,4 дл/г. Существенное влияние на вязкость растворов ФРК оказывает состояние структуры дермы: вид и возраст животного, шкура которого используется в качестве сырья, а также предварительная обработка дермы. Наименьшая характеристическая вязкость свойственна дисперсиям из коллагена шкур теленка, наибольшая – из коллагена шкур взрослых животных. Вязкость ФРК, полученного из гольевого спилка, значительно ниже по сравнению с вязкостью ФРК, полученного из дермы шкур.

Обычно ПРК хранят при температуре от + 100ºС до - 50ºС и ниже. Режим хранения ПРК зависит от продолжительности их нахождения в холодильной камере перед сушкой [21].

1.3 Оценка воздействия токсичных веществ на окружающую среду

Токсичность (от греческого toxikon-яд), способность вещества вызывать нарушения физиологических функций организма, в результате чего возникают симптомы интоксикаций (заболевания), а при тяжелых поражениях - его гибель. Интегральный показатель реакции организма на действие вещества, который во многом определяется механизмом его токсичного действия. Важное значение в проявлении токсичность вещества играют: скорость поступления вещества в кровь, скорость метаболических превращений вещества в крови и тканях внутренних органов, скорость проникновения его через гистогематические барьеры и взаимодействие вещества с биомишенями, а также некоторые другие факторы, определяющие величины токсодоз и особенности характера токсичного действия на организм. Под характером токсичного действия вещества на организм обычно подразумевают особенности механизмов токсичного действия, особенности патофизиологических процессов и симптомов интоксикации, динамику развития их во времени, а также другие стороны токсичного действия веществ. Эти особенности положены в основу токсикологические (физиологические) классификации веществ [22].

Действующая система контроля за загрязнением окружающей среды основана на количественном сравнении компонентного состава проб с предельно допустимыми концентрациями (ПДК) загрязняющих веществ. Опасность техногенного воздействия оценивается на основании суммарного коэффициента техногенного загрязнения, рассчитанного в соответствии с данными валового содержания химических элементов. Такой подход является не всегда эффективным. В настоящее время число веществ-загрязнителей, способных влиять на экологическое состояние биоты, превысило миллион наименований, и ежегодно синтезируется свыше четверти миллиона новых веществ [23].

В результате преобразований в природной среде происходит синтез новых соединений, которые могут быть токсичнее исходных ингредиентов. Примерами таких веществ могут быть метилртуть, соединения тяжелых металлов с детергентами, пестицидами и т. д. Вредное действие физических, химических и других факторов при их комбинировании может ослабляться (антагонизм) или усиливаться (синергизм). Изолированного действия не существует, есть лишь совместное действие всего комплекса факторов [24].

Разработка экологических нормативов применительно к почвам значительно отстает от создания нормативов для других сред (атмосфера, водные системы). Это связано со сложностью и неоднородностью объекта – почва состоит из четырех фаз: твердой, жидкой, газообразной и биотической. Это свойство почвы, отличающее ее от других природных сред, во многом затрудняет нормирование содержания загрязняющих веществ в почве и адекватную экологическую оценку почв, особенно в случае комплексного техногенного загрязнения [25].

В роли токсического вещества может оказаться практически любое химическое соединение, попавшее в организм в количестве, способным вызвать нарушение жизненно важных функций и создать опасность для жизни организма. Токсичность вещества тем больше, чем меньшее его количество (доза) вызывает расстройство жизнедеятельности организма. Вещество, вызывающее отравление или смерть при попадании в организм в малом количестве, называется ядом [26].

1.4 Особенности использования методов биотестирования и биоиндикации для состояния окружающей среды

Биотестирование - использование в контролируемых условиях биоло-гических объектов (тест-объектов) для выявления и оценки действия факторов (в том числе и токсических) окружающей среды на организм, его отдельную функцию или систему организмов. Хорошие результаты дает анализ бентосных (придонных) беспозвоночных. Оценка чистоты водоемов делается по преобла-данию, либо отсутствию тех или иных таксонов [27].

Биотестирование является обязательным элементом современной системы контроля качества вод. Подробную современную формулировку биотестирования дают А. А. Зенин и Н. Б. Белоусова: «Биотестирование – один из приемов определения степени токсического действия неблагоприятных факторов среды, потенциально опасных для живых организмов экосистем, в контролируемых экспериментальных лабораторных или натурных условиях путем регистрации изменений биологически значимых показателей исследуемых водных объектов с последующей оценкой их состояния в соответствии с выбранным критерием токсичности».

С помощью биотестирования определяют не концентрацию какого-либо вещества-загрязнителя, а выявляют его токсический эффект, то есть проявление токсичности. Величина токсического эффекта может быть прямо не связана с концентрацией загрязнителя. Она зависит от совместного действия многих факторов, таких как жесткость воды, активная реакция (pH), содержание кислорода, наличие веществ-комплексообразователей (гуминовых и других органических кислот), взаимного усиление или ослабления действия нескольких токсикантов [27].

Токсические вещества вмешиваются в нормальное протекание биохимических реакций в организме, нарушая тем самым функции его отдельных систем и органов.

В ответ на токсическое воздействие высокоорганизованные многоклеточные организмы (например, моллюски, рыбы, млекопитающие) отвечают генерализованной неспецифической (то есть универсальной) реакцией - стрессом, которая направлена на мобилизацию всех защитных сил организма и, если воздействие не слишком сильное, организм адаптируется к нему (компенсирует вредное влияние). Если этого сделать не удается (воздействие выходит за рамки адаптационных возможностей организма), то стрессовая реакция усиливается, не приводя к полезному результату. В итоге организм истощает свои ресурсы и гибнет. На первых этапах развития стресса организм начинает потреблять значительно больше энергии, чем в норме. Учащается частота дыхания и сердцебиения, активно расходуются питательные вещества [28].

В симптомах любого токсического воздействия на организм (отравления) можно выделить специфический (связанный именно с поражением определенного органа либо биохимической системы) и неспецифический (стрессовый) компонент. Поскольку главная задача биотестирования - выявление общей токсичности среды обитания организмов, а не определение в ней отдельных загрязнителей (на это есть специальные химические методы), то оценка интенсивности стрессовой реакции должна играть в биотесте решающую роль. Тем не менее, по отдельным специфическим реакциям тест-организма можно судить о наличии в тестируемой пробе каких-то определенных загрязнителей.

Биоиндикация - оценка качества среды обитания и ее отдельных характеристик по состоянию ее биоты в природных условиях.

В зависимости от скорости проявления биоиндикаторных реакций выделяют несколько различных типов чувствительности тест-организмов:

- биоиндикатор проявляет внезапную и сильную реакцию, продолжаю-щуюся некоторое время, после чего перестает реагировать на загрязнитель;

- биоиндикатор в течении длительного времени линейно реагирует на воздействие возрастающей концентрации загрязнителя;

- после немедленной, сильной реакции у биоиндикатора наблюдается ее затухание, сначала резкое, затем постепенное;

- под влиянием загрязнителя реакция биоиндикатора постепенно стано-вится все более интенсивной, однако, достигнув максимума постепенно затухает;

- реакция и типы неоднократно повторяются, возникает осцилляция био-индикаторных параметров [29].

Требования к биоиндикаторам:

- накопление загрязняющих веществ не должно приводить к гибели тест-организмов;

- численность тест-организмов должна быть достаточной для отбора, то есть без влияния на их воспроизводство;

- в случае долгосрочных наблюдений предпочтительны многолетние ви-ды флоры;

- фитотесты должны быть генетически однородными;

- должна быть обеспечена легкость взятия проб;

- должна реализоваться относительная быстрота проведения тестирова-ния;

- биотесты должны обеспечивать получение достаточно точных и воспро-изводимых результатов;

- биоиндикаторы должны быть одновозрастными и характеризоваться, по-возможности, близкими свойствами;

- диапазон погрешностей измерений (по сравнению с классическими или эталонными методами тестирования) не должен превышать 20 - 30%;

- при выборе тест-организмов предпочтение следует отдавать регистра-ции функциональных, этологических, цитогенетических изменений отдельных индикаторных процессов биоты, а не только изменению ее структуры, численности или биомассы, так как эти последние являются более консервативными [30].

Оценка проб среды с использованием тест-организмов и наблюдение за состоянием биообъектов, вносимых в контролируемую экосистему в разнообразных садках, представляет собой биотестирование.

Биотестирование выполняет функцию тактического контроля происходящего загрязнения, нацеленного на получение быстрого сигнала о токсичности и необходимой степени разбавления конкретных стоков. На водном объекте оно может быть эффективным с момента начала загрязнения до его завершения. Биоиндикация выявляет результат произошедшего вредоносного воздействия на окружающую среду. Может применяться на экологическом объекте постоянно, но эффективность его станет очевидной при начале неблагоприятных экологических изменений. Эти три элемента общей природоохранной стратегии дополняют, но не способны заменить друг друга.

Условия, определяемые с помощью организмов-биоиндикаторов, называются объектами биоиндикации. Ими могут быть как определенные типы природных объектов (почва, воздух, вода), так и различные свойства этих объектов (механический, химический состав) и определенные процессы, протекающие в окружающей среде (эрозия, заболачивание и тому подобное), в том числе происходящие под влиянием человека. Среди особых преимуществ биологических методов следует отметить то, что они позволяют фиксировать негативные изменения в природной среде при низких концентрациях загрязняющих веществ [31].

Использование биоиндикаторов позволяет:

- обнаруживать места скоплений в экологических системах различного рода загрязнений;

- проследить динамику изменений в окружающей среде;

- определить степень вредности тех или иных веществ для живой приро-ды, в частности для человека;