Оценка токсикологических свойств продуктов растворения коллагена

Ресурсы промышленного коллагенового сырья как наземных животных, так и гидробионтов весьма велики. Однако коллагенсодержащие ресурсы наземных животных изучены более основательно, чем сырье водных гидробионтов.

Коллаген обладает высокоупорядоченной структурой, химической и термической стабильностью, может быть выделен в виде растворов или нерастворимых волокон [10].

Основными достоинствами коллагена как нового пластического материала являются отсутствие токсических и канцерогенных свойств, слабая антигенность высокая механическая прочность и устойчивость к тканевым ферментам, регулируемая скорость лизиса в организме, способность образовывать комплексы с биологически активными веществами, стимуляция регенерации собственных тканей организма. В этом отношении препараты из коллагена имеют преимущества перед препаратами из других биополимеров, в частности из фибрина или желатина, являющегося денатурирующим коллагеном [11].

Появление методов полного растворения коллагена позволило получать растворы в неограниченном количестве из любого коллагенсодержащего сырья, в том числе из отходов кожевенного производства. Это значительно расширило возможности широкого применения коллагена в различных областях медицины, так как из раствора можно получить волокна, аналогичные коллегановым волокнам соединительной ткани, а также пленки, губки, нити, трубы и другие материалы и изделия. Все это позволило широко использовать коллаген  в пластической хирургии в качестве шовного материала для лечения ран, ожогов, трофических язв и так далее [12].

Молекула коллагена представляет собой правозакрученную спираль из трёх α-цепей. Такое образование известно под названием тропоколлаген. Один виток спирали α-цепи содержит три аминокислотных остатка. Молекулярная масса коллагена около 300 тысяч, длина 300 нм, толщина 1,5 нм.

Для первичной структуры белка характерно высокое содержанием глицина, низкое содержание серосодержащих аминокислот и отсутствие триптофана. Коллаген относится к тем немногим белкам животного происхождения, которые содержат остатки нестандартных аминокислот: около 21% от общего числа остатков приходится на 3-гидроксипролин, 4-гидроксипролин и 5-гидроксилизин. Каждая из α-цепей состоит из триад аминокислот. В триадах третья аминокислота всегда глицин, вторая — пролин или лизин, первая — любая другая аминокислота, кроме трёх перечисленных [13].

Коллаген существует в нескольких формах. Основная структура всех типов коллагена является схожей. Коллагеновые волокна образуются путем агрегации микрофибрилл, имеют розовый цвет при окраске гематоксилином и эозином и голубой или зеленый при различных треххромных окрасках [14].

1.1 Способы получения коллагена из отходов кожевенного                  производства

Существующие в настоящее время технологии получения растворимых форм коллагена весьма энергоемки, требуют потребления большого количества воды, использования далеко не безвредных химикатов в достаточно высоких концентрациях, что ведет к дополнительным затратам  на очистку сточных вод.

Главной целью переработки отходов является коллаген. Считается, что из всего количества коллагена, которое содержится в кожевенном сырье, в готовой продукции остается только 40%. Коллагенсодержащими отходами являются мездра, сырьевая и гольевая обрезь, спилок, который не пригоден для изготовления кожи, хромовая стружка, отходы готовых кож и белки, содержащиеся в сточных водах. К не менее важным отходам кожевенного производства относятся волос и щетина, а также осадки, образующиеся при очистке сточных вод.

Мездра - нижний слой шкуры (подкожная клетчатка), отделяемый от дермы при выделке кожи. Количество мездры, отделяемой при мездрении, составляет 20 - 30% от массы шкуры. Для предотвращения разложения мездры при хранении обычно консервируют путём сушки, замораживания, обработки суспензией извести или сухой известью. Мездра содержит около 75% воды, белковые (главным образом коллаген) и жировые вещества [15].

Спилок, слой дермы, полученный при двоении (разделении на слои) полуфабриката в производстве кожи. Различают спилок лицевой, средний и мездровый (или бахтармяный). Из тонкого лицевого спилка производят фотокожу или галантерейную кожу. Лицевой спилок сравнительно большой толщины и средний спилок служат для получения кожи, используемой в основном для изготовления обуви. Из бахтармяного спилка вырабатывают велюр для обуви и одежды, а также кожи хромового дубления для верха обуви и юфть, имеющие искусственную лицевую поверхность. Мелкий спилок и спилковую обрезь (откраиваемые тонкие края) используют для приготовления технического желатина, клея и др. продуктов растворения коллагена [16].

Хромовая стружка, являющаяся неотъемлемой частью кожевенного производства и одним из наиболее ценных его отходов, состоит из двух компонентов — белка и хромового дубителя. Разделение этих компонентов открывает обширные возможности для дальнейшего использования, прежде всего белковой составляющей.

Одним из направлений рационального использования отходов и малоценного коллагенсодержащего сырья мясной промышленности являются перевод его в растворимое состояние и последующее получение из продуктов растворения искусственных коллагеновых материалов. В нашей стране наиболее распространенными являются щелочно-солевой (однако этот способ достаточно длителен и  также требует значительных затрат на реактивы и очистку сточных вод) и ферментативный способы растворения [17].

1.2 Способы получения продуктов растворения коллагена

В настоящее время научный и практический интерес представляют продукты растворения коллагена (ПРК), из которых получают различную продукцию для народного хозяйства.

Все типы растворимого коллагена можно разделить на два класса. К первому относится коллаген, полученный прямой экстракцией соединительной ткани. Различают кислоторастворимый и нейтрально-солерастворимый коллаген, экстрагируемые соответственно кислыми буферами и нейтральными солевыми растворами. Ко второй категории относятся растворы зрелого коллагена, получаемые после предварительной ферментативной, химической и механической обработки ткани [18].

1.2.1 Кислые дисперсии коллагена

Получение ПРК (кислых дисперсий коллагена) заключается в обработке коллагенсодержащего сырья щелочно-солевым раствором (10% гидроксида натрия в 1М растворе сульфата натрия) с последующим растворением его в кислоте (1М уксусной).

В процессе щелочно-солевой обработки в коллагене происходит расщепление различных типов поперечных связей, в том числе и ковалентных, без значительного нарушения связей в главных полипептидных цепях, благодаря присутствию сильно обезвоживающей соли. В последующем процессе кислотного растворения окончательно разрушается большая часть поперечных (главным образом водородных) связей. При этом в раствор переходят элементы, сохранившие основные черты нативного коллагена. Они имеют высокую степень асимметрии и являются палочкообразными трехспиральными частицами.

Итак, продукты растворения коллагена представляют собой дисперсию практически зрелого коллагена и, кроме того, они содержат в виде механической взвеси частички эластиновых и, вероятно, ретикулиновых волокон. Количество не растворяющейся части составляет примерно 3 - 5%. Дисперсия содержит низкомолекулярные вещества: азотсодержащие (аминокислоты и пептиды) - 1,2 - 1,8%, минеральные до 1%, мукополисахариды до 0,35%. Причем, количество гексоз (0,30%) и глюкозамина (0,03 %), содержащееся в составе ПРК, примерно такое же, как и количество гексоз (0,24%) и глюкозамина (0 - 0,02%), содержащееся в тщательно очищенных препаратах проколлагена, в которых освободиться полностью от мукополисахаридов, не нарушая спиральной конформации, невозможно.

ПРК даже при очень низких концентрациях (0,5 - 1%) имеют высокую вязкость, в десятки раз превышающую вязкость растворов желатина при тех же концентрациях. Вязкость продуктов растворения можно несколько уменьшать удлинением продолжительности щелочно-солевой обработки, некоторым увеличением концентрации щелочи и изменением температуры, а также прибавлением к ним небольшого количества электролитов и с помощью механических и ультразвуковых воздействий.

Чем сильнее кислота, тем большей диспергирующей способностью она обладает по отношению к коллагену, и тем меньше молекулярная масса частиц ПРК в дисперсии.

Дисперсии коллагена в растворах уксусной и акриловой кислот являются псевдопластическими жидкостями, в растворах салициловой и щавелевой кислот являются малопрочными твердообразными системами, то есть имеют предел текучести (или статистическое предельное напряжение сдвига), что может быть связано с бифункциональностью этих кислот.

С целью усовершенствования технологии наработки принудительного растворения коллагена и обеспечения высокого качества конечного продукта, разработан универсальный способ получения коллагеновой дисперсии, позволяющий осуществлять наработку коллагена из любого вида коллагенсодержащих отходов, применяя в случае необходимости на первых стадиях технологического процесса такие технологические операции, как обеззоливание (для отходов шкур, прошедших золение) или обезжиривание (для отходов, содержащих более 10% жировых веществ). Продолжительность технологического цикла при проведении операций по предлагаемому способу без ультразвуковой обработки на 34 часа меньше, чем по известному способу, а с применением ультразвука каждая операция сокращается в среднем в 5 - 8 раз. Обеспечение высокого качества коллагеновой дисперсии достигается за счет того, что полученную путем предварительной щелочно-солевой обработки и растворения в органической кислоте коллагеновую массу диализуют относительно проточной воды до нейтральных значений рН, удаляя все низкомолекулярные примеси, а затем (в зависимости от целевого назначения конечного продукта) перерастворяют в определенной органической кислоте. При использовании рекомендуемых режимов выход белка увеличивается до 91,7 - 92,4% . Коллагеновая дисперсия, полученная по данному способу, в отличие от дисперсии, полученной по стандартной технологии, практически не содержит посторонних белков, углеводных компонентов, жировых веществ и на 1,67% меньше содержит минеральных жировых веществ.

Также разработан еще один способ получения кислой дисперсии коллагена. Он заключается в замене предварительной щелочно-солевой подготовки коллагенсодержащего сырья к растворению на щелочно-пероксидную. Проведенные эксперименты позволили подобрать такое соотношение щелочи и пероксида, при котором достигается эффект максимального разрыхления структуры гольевой спилковой обрези, что способствует очистке коллагена от сопутствующих компонентов и облегчает его последующее растворение в слабых органических кислотах [19].

              1.2.2 Щелочные дисперсии коллагена

Как было отмечено ранее, концентрация щелочи при щелочно-солевой обработке влияет на интенсивность воздействия на коллаген, и при содержании NаОН в системе NаОН/Nа2SO4 выше 10% интенсивность воздействия возрастает настолько сильно, что коллаген начинает растворяться даже в воде. Совместив химические воздействия щелочно-солевой системы, сильное измельчение и механические воздействия, получили щелочную дисперсию коллагена (ЩДК) в воде непосредственно после щелочно-солевой обработки.

Полученная дисперсия имеет рН = 11 - 12. Изоэлектрическая точка щелочных дисперсий коллагена находится при рН = 5,5 - 6. Вязкость щелочной дисперсии коллагена зависит от продолжительности щелочно-солевой обработки, значительно уменьшаясь с ее удлинением. Следовательно, чем продолжительнее воздействие щелочно-солевой системы, тем большей деструкции подвергаются частицы коллагена.

Надо отметить, что при большем сухом остатке вязкость щелочных дисперсий коллагена ниже, чем у кислых ПРК. Считают, что, в результате получения щелочной дисперсии в раствор переходят частицы коллагена несколько иной формы, чем у кислых ПРК. Предполагают, что эти частицы менее асимметричны, чем и объясняется более низкая вязкость щелочных дисперсий [20].

              1.2.3 Дисперсии коллагена, полученные с помощью ферментов

Большие возможности по подготовке коллагенсодержащего сырья к растворению открываются при использовании ферментных препаратов. Ферменты являются специфическими биологическими катализаторами, расщепляющими определенные типы - связей, поэтому действие их на коллаген более специфично, чем действие других веществ. Для предварительных ферментативных воздействий на коллаген используют такие ферменты, которые не нарушают трехспиральной структуры коллагена, а разрушают межцепочечные связи.

Ранее проводились работы по получению ферментно - растворимого коллагена (ФРК). Для этой цели были использованы нейтральные (протосубтилин) и слабокислые (проторизин) протеиназы, а также пектаваморин, α-амилаза, пепсин, аспергилпепсин. Было доказано, что полного растворения коллагена с большим успехом можно добиться при использовании кислых протеиназ, Концентрация белка в полученных при этом растворах достигает 2%, а выход – 98%. За рубежом используются растворы коллагена, получаемые после обработки соединительных тканей ферментами: пепсином, трипсином, проназой и др.

Ряд способов получения дисперсий коллагена с использованием ферментных препаратов разработан в Болгарии. Один из них заключается в растворении коллагенсодержащих отходов овчины с помощью протеолитического ферментного препарата субтилизина. Обрабатывающий раствор содержит фермент, карбонат натрия, хлорид кальция, консервирующие вещества, рН поддерживается в пределах 8,4 – 8,7. К обрабатывающему раствору добавляют уксусную кислоту до 0.05М концентрации с целью инактивации фермента и переведения коллагена в раствор. Продолжительность обработки двое суток. Полученную дисперсию отделяют от шерсти центрифугированием и подвергают нейтрализации до рН = 7,3 - 7,6. Преимущество способа – отсутствие предварительного измельчения и обезволашивания отходов.