Оценка токсикологических свойств продуктов растворения коллагена

- составить прогноз дальнейшего развития экосистемы [32].

Регистрирующие биоиндикаторы реагируют на изменение внешней среды изменением численности, фенооблика, изменением скорости роста, соматическими проявлениями (в том числе уродливостью) и другими хорошо заметными признаками. Примером таких биоиндикаторов служат лишайники и хвоя деревьев (хлороз, некроз) и их суховершинность [33].

Накапливающие биоиндикаторы концентрируют загрязняющие вещества в своих тканях, определенных органах и частях тела, которые в последующем используются для выяснения степени загрязнения окружающей среды при помощи химического анализа. В качестве примера можно назвать хитиновые панцири ракообразных и личинок насекомых, обитающих в воде, мхи, печень млекопитающих [34].

Ветвистоусые рачки дафнии обычно имеют длину не более 2 - 3 мм, характеризуются двумя парами усиков-антенн, ясно выраженной головой с большим сложным глазом, состоящим из двух десятков простых глазков, четырьмя парами ножек и мешковидным выростом с яйцами на спине. Антенны небольшие, но сильно развиты, двуветвистые и служат для плавания. Голова дафний спереди вытянута в остренький «клюв», тело покрыто прозрачной двустворчатой раковинкой из тонкого хитина, брюшные ножки скрыты под раковинкой, на грудных ножках находятся жаберные лепестки. У дафний даже есть сердце. Сердце дафний, сокращаясь несколько десятков раз в минуту, проталкивает кровь вначале к голове, а затем к жабрам и заднему концу тела. Питаются дафнии мелкими водорослями и бактериями. В течение лета рачки размножаются партеногенетически, нося неоплодотворенные яйца на спине, в так называемой выводковой камере. Самцы у дафний редки, появляются обычно к осени и всегда значительно мельче самок [35].

1.5 Характеристики тест-объектов

1.5.1 Характеристика тест-организма Daphnia magna Straus

Тест-организм – это и есть то живое существо, по реакциям которого судим о токсичности.

В качестве тест-объекта используется Daphnia magna Straus. Относится к низшим ракообразным, отряду ветвистоусых. Дафнии обитают в планктоне стоящих и слабопрочных пресноводных водоемов, широко распространены на территории России.

Тело дафний овальной формы, сжато с боков, заключено в прозрачный панцирь. Тело нечетко сегментировано на головной, грудной и брюшной отделы. Голова покрыта щитом, передний край которого вытянут, образуя рострум. Под рострумом расположены две пары конечностей: антеннулы и антенны, последние сильно развиты, служат дл скачкообразного перемещения в толще воды. Пять пар грудных конечностей сильно расчленены, снабжены щетинками, служат для фильтрации воды, питания, дыхания. Брюшной (абдоминальный) отдел туловища заканчивается постабдоменом, дорсальный край которого имеет выемку, характерную для дафний данного вида. В головном отделе, не покрытом раковиной, расположена пара глаз: большой – сложный, аленький – простой. Под панцирем дафний легко различимы сердце, кишечник, выводковая камера, которая в спинной части туловища. В выводковой камере протекает эмбриональное развитие дафний [36].

Рост, развитие и размножение. Наиболее интенсивно дафния растет первые дни после рождения, при каждой линьке сбрасывая старый панцирь. Оптимальное питание обеспечивает удвоение размеров рачков в промежутке между линьками. После наступления половой зрелости рост дафний замедляется, снижается и частота линек. Всего в течение жизни дафния может линять до 24 раз. Выметанная молодь имеет длину 0,7 - 0,9 мм, половозрелые самки – 2,2 - 2,4 мм, самцы – 2,0 - 2,1 мм. Максимальные размеры самок – 6,0 мм при сыром весе 7 - 10 мг. В природе в летнее время, а в лаборатории при оптимальных условиях культивирования круглый год дафнии размножаются без оплодотворения – партеногенетически (рождаются только самки). При резком изменении условий существования или культивирования (похолодание, голод, перенаселенность) в культуре появляются самцы. Самки отличаются от самок меньшими размерами, видоизмененной формой тела, антеннул, постадомена. Резкое изменение условий существования вызывает переход к половому размножению, дафний откладывают «зимние яйца», размещающиеся в эффипиуме, образованном из части створок панциря. При очередной линьке эффириум отделяется (в природе – осенью), падает на дно водоема, где яйца проходят  стадию зимнего покоя. Весной из них появляются самки, снова переходящие к партнерогенетическому размножению.

Период созревания при оптимальной температуре (+ 20 ± 2°С) и хорошем питании – 5 - 8 суток, длительность эмбрионального развития – 3 - 4 суток, а при повышении температуры до 25°С – 46 часов. Затем происходит вымет молоди (партеногенетических самок) каждые 3 - 4 суток. Количество молоди у молодых самок – 10 - 15, у зрелых – 30 - 40 особей. В природе дафнии живут в среднем 20 - 25 суток, а в лаборатории при оптимальном режиме 3 - 4 и более. При температуре свыше 25°С продолжительность жизни дафний может сокращаться до 25 суток. Голодание увеличивает продолжительность жизни, но задерживает рост и наступление линек.

Питание и отношение к содержанию кислорода. По характеру питания относятся к фильтраторам, в природе дафнии питаются взвешенными в воде бактериями, одноклеточными водорослями, детритом, растворенными органическими веществами. Пища поступает с потоком воды, направленным грудными конечностями, через выросты – в брюшной желоб вдоль основания конечностей и ко рту рачка. Оптимальное для жизнедеятельности дафний содержание растворенного в воде кислорода – 6 - 7 мг/дм³. Однако дафния достаточно устойчива к изменению кислородного режима и снижению растворенного в воде кислорода до 2 мг/дм³ и ниже, что связано с ее способностью синтезировать гемоглобин. Повышение содержания гемоглобина в крови дафний при ухудшении кислородного режима сопровождается окрашиванием рачков в красный цвет [37].

1.5.2 Характеристика тест-объекта лабораторной культуры зеленых протококковых водорослей Scenedesmus quadricauda

Данный вид относиться к ценобиальным организмам, у которых размножение происходит путем образования внутри материальной клетки 2-х, 4-х, реже 8- и 16-клеточных ценобиев. Ценобии – это смыкание одноклеточных водорослей в колонию из клеток и той же генерации, одно рядные в виде плоских пластинок. Клетки удлиненно – овальные, с закругленными концами, одноядерные. Краевые клетки ценобия каждая с двумя длинными шипами на концах. Оболочка гладкая. Размеры клеток (7 - 43) · (2,5 - 16) мкм. Размножение автоспорами. Иногда (особенно в условиях культивирования водорослей) вместо ценобиев образуются отдельные клетки. Вид широко распространен в разнообразных биотопах, главным образом в планктоне пресных водоемов, часто независимо от климата [38].

* * *

Таким образом, анализ литературы показал, что коллагенсодержащие отходы являются очень ценными, а также требуется их утилизация, что зачастую не происходит на предприятиях кожевенно-меховой промышленности, так как требуются большие затраты. Коллаген при производстве различной продукции подвергается воздействию кислот, солей, щелочей, воды и других веществ.

Известные способы получения ПРК являются достаточно агрессивными, поэтому получение ПРК на основе вторичных продуктов пищевой промышленности являются актуальными.

Установлено, что перед любой перерабатывающей промышленностью всегда стоят задачи повышения эффективности использования сырья, сокращения отходов производства, расширения ассортимента и повышения качества выпускаемой продукции.

2 Экспериментальный раздел. Проведение биотестирования на     водных вытяжках из ПРК

2.1 Объекты исследования

Для оценки токсикологических свойств использовались следующие продукты растворения коллагена на основе:

- ледяной уксусной кислоты (1*);

- курунговой закваски, культивированной на творожной сыворотке (2*);

- кефирных грибков, культивированных на сыворотке (3*);

- кефирных грибков, культивированных на молоке (4*);

- курунговой закваски, культивированной на молоке (5*).

2.2 Методы исследования

2.2.1 Методика получения ПРК

Технология получения ПРК кислотным способом из шкуры крупного рогатого скота пресно-сухого способа консервирования.

Отмока пресно-сухого сырья. На загруженное в барабан сырье заливали воду при температуре 20 - 22ºС. Через 12 - 14 часов смену воды и добавили химические материалы в количестве: ПАВ – 1,0 - 1,5 г/дм³; Na2SO3 – 3,5 - 4,0 г/дм³; Na2SiF6 – 0,75 г/дм³. (ЖК) 4,0 - 5,0. Продолжительность – 24 - 32 часа.

Золение сырья. Приготовленную зольную жидкость ((NH4)2SO4 – 0,3%; Na2S (60%) 3,2%; Ca(OH)2 (96%) – 4,6%) подавали в аппарат. Производили вращение в течение 30 минут, далее по 1 часу через каждый час покоя: вращение 5,5 ч, покой 5 ч. (ЖК) = 2,0 - 3,0 при температуре воды 20 - 22ºС.

Обеззоливание сырья. Полное или частичное удаление извести, находящейся в коже от процессов обезволашивания – золения.

Промывка голья. Промывку проводили в 500% количестве воды при температуре 20 - 22ºС.

Мездрение. Удаление со шкуры подкожного слоя — мездры при производстве кожи и меха.

Для предварительной подготовки растворения коллагена использовали   щелочно-солевую обработку.

Щелочно-солевой метод получения продуктов растворения коллагена (ПРК). Шкуру КРС после процесса золения промывали проточной водой в течение 24 часов, затем нарезали на кусочки размером 2 на 2 см. Полученную массу взвешивали и подвергали солевой обработке при температуре 18 - 20ºС, (ЖК) = 3,0, концентрации Na2SO4 40 г/дм³ и продолжительности обработки 4 часа.

После солевой обработки проводили щелочно-солевую обработку: NaOH 100 г/дм³ и Na2SO4 - 142 г/дм³, (ЖК) = 3,0, при температуре 18 - 20ºС, в течение 60 часов.

Далее проводили промывку раствором Na2SO4 40 г/дм³ при (ЖК) = 3,0, температуре 18 - 20ºС в течение 4 часов.

Для удаления избытка щелочи проводили нейтрализацию раствором Na2SO4 10% от массы материала. Нейтрализацию проводили при рН = 4 до отсутствия розового окрашивания фенолфталеином на срезе образца.

Материал тщательно промывали водой до отсутствия в промывных водах сульфат ионов (качественная проба с BaCl2).

2.2.2 Методика получения ПРК на основе кефирных грибков, культивированных на молоке

Для получения кисломолочной композиции брали обезжиренное молоко объемом 1 л и готовую закваску кефирных грибков объемом 100 см³, и культивировали при 37ºC в течении 24 часов. Затем доводим до достижения требуемой титруемой кислотности, 280ºT, ежедневно внося по 100 см³ молока (1,5% жирности).

Определение титруемой кислотности проводили следующим образом: в коническую колбу вместимостью 100 см3 пипеткой вносили 10 см3 молока, 20 см3 дистиллированной воды и добавляли три капли фенолфталеина. Содержимое колбы тщательно перемешивали и титровали из бюретки раствором гидроксида натрия с С = 0,1 моль/дм3 до появления слабо – розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Титруемую кислотность (К, ºТ) рассчитывали по формуле (1):

К = V 10,                                                         (1)

Полученную кисломолочную композицию объемом 1 л растворяли в 1 кг ПРК.

Аналогично данному способу были получены остальные кисломолочные композиции.

2.2.3  Подготовка к биотестированию

Условия проведения биотестирования. Биотестирование проводили в нормальных лабораторных условиях, не содержащих токсических паров и газов, а также следов обработки помещения инсектицидами, пестицидами.

Температура окружающего воздуха в лаборатории от + 18 до + 24°С.

Атмосферное давление 84 - 106 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.).

Освещенность для дафний 1000 лк, для водорослей 3000 лк.

Подготовка культивированной воды. Для подготовки культивационной воды питьевую воду отстаивали и аэрировали в течении 3 - 7 суток (до полного дехлорирования) в бутылях из бесцветного стекла в присутствии высшей водной растительности (3 г. по воздушно-сухой массе аквариумной растительности на 1 дм³ питьевой воды).

Выращивание и содержание маточной культуры дафний. Культуру дафний выращивали в эквивалентном приспособлении, обеспечивающем поддержание искусственного освещения лампами дневного света с интенсивностью света 1000 лк, 16-часовой световой и 8-часовой ночной (без освещения) период; температуру 20 ± 2ºС.

В качестве культиваторов использовали чашки кристаллизационные толстостенные, которые наполняли на ¾ объема культивационной водой, сажали туда самок дафний среднего размера с выводковыми камерами, заполненными эмбрионами, и неплотно прикрывали культиваторы (от попадания пыли и для уменьшения испарения) пластинами из стекла толщиной не менее 6 мм. Кормление дафний производилось ежедневно.

Подготовка корма и кормление. Дафниям обеспечивали комбинированное дрожже-водорослевое питание. В качестве корма использовали зеленые водоросли родов Scenedesmus.

Водоросли для кормления дафний выращивали в плоскодонных колбах объемом 250 см³ при 12 часовом освещении лампами дневного света (освещенность 3000 лк), температуре от + 22 до + 25ºС, на питательной среде. Питательные растворы готовили на дистиллированной воде.

Таблица 1 – Состав питательной среды для культивирования водорослей