Лекции по "Основам биотехнологии"

 

В зависимости  от реакции на кристаллы насекомые  делятся на три группы:

• характерен общий паралич;
• паралич среднего отдела кишечника;
• реакция на препарат в целом: гибель в результате прорастания спор и последующего размножения бактерий.

 

Бактерии Bac. thuringiensis антагонистичны к 130 видам насекомых. Наибольший эффект достигается при применении препаратов этой группы против листогрызущих вредителей. Наиболее распространенные препараты на основе различных вариаций Bac. thuringiensis: энтобактерин, инсектин, алестин, экзотоксин, токсобактерин, дендробациллин, битоксибациллин.

Промышленное производство энтомопатогенных бактерий (ЭБ) заключается  в глубоком культивировании. При этом ставится задача получения максимального титра клеток в культуральной жидкости и накопления токсина. Требования к промышленным штаммам ЭБ: принадлежность штамма к определенному серотипу, высокая вирулентность и продуктивность на промышленных средах, устойчивость к комплексу фагов и т.д. Технология производства включает все стадии, типичные для любого биотехнологического производства. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной (28-30^оС), продолжительность ферментации составляет 35-40 часов. Используют дрожже-полисахаридную среду, содержащую в процентах: кормовые дрожжи - 2-3; кукурузную муку - 1-1.5; кашалотовый жир - 1. Перед началом культивирования рН составляет около 6.3, к концу ферментации - повышается до 8.0 - 8.5, что может привести к разрушению кристаллов на более мелкие фрагменты и затруднить их выделение. Чтобы предотвратить это, культуральную жидкость перед переработкой подкисляют до 6.0 - 6.2. Культивирование заканчивают при степени споруляции 90-95% и титре спор не менее 109 в 1 мл. После сепарации культуральной жидкости получают пасту влажностью 85% с выходом около 100 кг в 1 кубометре культуральной жидкости и титром порядка 20*10⁹ спор в 1 грамме. Фугат можно употребить для приготовления питательной среды, но не более 1-2 раз, так как в культуральной жидкости накапливаются вещества, ингибирующие развитие культуры. Фугат находит свое применение в качестве сырья при производстве кормовых дрожжей, что обеспечивает сокращение промышленных стоков и снижает расход воды. Пасту перемешивают в течение получаса для однородного распределения спор и кристаллов и отбирают пробы на проверку титра, влажности, вирулентности, наличия фага.

Конечный продукт - смачивающий  порошок или стабилизированная  паста. Первый получают путем высушивания увлажненной пасты на распылительной сушке. Готовый препарат фасуют по 20 кг в четырехслойные крафт-мешки с полиэтиленовым вкладышем. Вторую - внесением в пату КМЦ. При смешении молекулы КМЦ сорбируют белковые кристаллы и споры, заряжая их отрицательно, что способствует равномерному распределению активного начала по всему объёму и увеличению срока хранения. Готовый препарат - вязкая жидкость кремового или светло-серого цвета, без запаха, не замерзающую при хранении. Препарат предназначен для борьбы с садово-огородными вредителями, эффективен против 60 видов насекомых. Применяют путем опрыскивания растений водной эмульсией в период активного роста вредителя. Основная масса вредителей погибает в течение 2-10 дней. На 1 га расходуют: для овощных культур 1-3 кг, садовых - 3-5 кг.

 

 

ТЕХНОЛОГИЯ  ПОЛУЧЕНИЯ ГРИБНЫХ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

 

Энтомопатогенные препараты  на основе микроскопических грибов вызывают у насекомых микозы. Грибы обладают рядом особенностей:

• поражение происходит через кутикулу;
• насекомые поражаются в фазе развития куколки и имаго;
• большая скорость роста и огромная репродуктивная способность, в виде спор могут длительное время находится в природе без снижения энтомопатогенной активности;
• высокая специфичность, вирулентность сильно зависит от штамма гриба.

 

Действие грибного препарата  на насекомое начинается с проникновения  споры в полость тела через  кожные покровы. Попав в тело, спора  прорастает в гифу, затем разрастается мицелий, от которого отчленяются конидии.

Оказавшись в теле, конидии циркулируют в гемолимфе. Уже на этой стадии возможно поражение  насекомого вследствие выделения некоторыми штаммами значительного количества токсинов. В отсутствие токсина мицелий  постепенно заполняет все тело насекомого, прежде всего поражается мышечная ткань. Рост гриба продолжается до тех пор, пока все ткани не будут разрушены. Могут образовываться конидиеносцы, прорывающие кутикулу и обволакивающие мертвую личинку.

В промышленном производстве используются отдельные штаммы в основном трех родов: Beaveria, Metarrhizium, Entomophtora. В нашей стране освоено промышленное производство препарата боверина на основе B.bassiana. Готовый препарат - порошок кремового или белого цвета, содержащий в 1 г от 1.5 до 6 млрд. конидиоспор. Препарат безвреден для теплокровных животных и человека, не вызывет ожогов у растений.

Получать боверин можно  используя как поверхностное, так  и глубинное культивирование. Первый способ более трудоемок и длителен, поэтому имеет ограниченное значение. Производство конидиоспор при выращивании его в жидкой среде также непростая задача. Основная трудность в том, что при этом способе культивирования гриб размножается вегетативно, образуя гонидии. Гонидии по вирулентности не уступают конидиям, однако неустойчивы к высоким температура на стадии высушивания. При традиционной распылительной сушке погибает 90% гонидиоспор и 20-50% конидиоспор. Проблема решается подбором питательной среды и условий ферментации, обеспечивающих переход 90% выращенных клеток в конидиоспоры.

Технология получения  боверина методом глубинного культивирования  включает обычные стадии. Питательная  среда содержит в процентах: дрожжи кормовые - 2, крахмал - 1, хлорид натрия - 0.2, хлорид марганца - 0.01, хлорид кальция - 0.05. Последний компонент обеспечивает устойчивость конидий к неблагоприятным факторам, поэтому его содержание может сильно варьировать (до 5%). Культивируют при рН 4.5-5.6, температуре 25-28^оС 3-4 суток в условиях постоянного перемешивания и аэрации. В среде необходимо также наличие аминного азота, так как его недостаток снижает скорость роста культуры и процент образования конидиоспор, избыток ведет к образованию гонидий. Культуральную жидкость подвергают сепарации и фильтрованию, после чего пасту сушат на распылительной сушке.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ТЕХНОЛОГИЯ  ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

 

Из всех энтомопатогенных препаратов вирусные обладают наибольшей специфичностью по отношению к насекомому-хозяину. Они поражают не более одного вида. Их ярко выраженная специфичность обуславливает практическую безвредность вирусных препаратов для человека, флоры и фауны.

Вирусы отличает высокая  устойчивость к неблагоприятным  факторам окружающей среды, они способны сохранять активность в течение 10-15 лет, находясь вне насекомого. Заражение вирусом происходит при питании вредителя. Попавшие в кишечник тельца-включения при щелочных значениях рН разрушаются. Освобожденные вирионы проникают через стенку кишечника в клетки, где в ядрах происходит репликация вирусов. Высвободившиеся вирусы заражают другие клетки, что в итоге приводит к гибели насекомого. Отличительной особенностью вирусов является то, что они могут размножаться только в живой ткани. Это создает определенные трудности в организации промышленного производства, так как технология размножения вирусов должна быть связана с использованием живых насекомых-хозяев.

В России осуществляется выпуск трех вирусных энтомопатогенных препаратов: вирин-ЭКС (против капустной совки), ЭНШ (против непарного шелкопряда) и АББ (против американской белой бабочки).

Производство любого из вирусных препаратов начинают с  разведения насекомого-хозяина на искусственных  питательных средах, обеспечивающих их физиологически здоровое состояние. На определенной стадии развития ( обычно на стадии гусеницы) насекомых заражают, добавляя вирусную суспензию к корму. При этом инокулят предварительно получают от нескольких больных личинок. После заражения насекомых выдерживают в строго определенных условиях, обеспечивающих максимальное накопление вируса в тканях. Через 7-9 суток собирают мертвые и отмирающие личинки, подсушивают при температуре 33-35^оС, измельчают механическим способом для вывода телец-включений из тканей. К полученной массе добавляют физиологический раствор или дистиллированную воду из расчета 1 мл на гусеницу, взвесь полученных тканей фильтруют.

При производстве вирин-ЭКС  полиэдры осаждают из фильтрата центрифугированием. Осадок суспендируют в минимальном  количестве дистиллированной воды и  добавляют простерилизованный глицерин до титра 1 млрд. полиэдров в 1 мл. Готовый препарат разливают во флаконы. При производстве вирин-ЭНШ в фильтрат добавляют лактозу, а после перемешивания ацетон в соотношении 4:1 к объему суспензии. После отстаивания надосадочную жидкость сливают, осадок подсушивают до полного удаления ацетона. Если препарат планируется выпускать в виде порошка, то сухой осадок смешивают с мелкодисперсным наполнителем (каолином, например) до получения титра полиэдров 1 млрд. полиэдров в 1 грамме.

Масляную форму препарата  получают путем диспергирования осадка в стерильном 50% растворе глицерина до титра 2 млрд. полиэдров в 1 мл, а затем добавляют равный объем солярового масла, перемешивают и разливают по флаконам. Вирусные энтомопатогенные препараты применяют путем внесения полиэдров в плотные популяции насекомых-вредителей с целью возникновения в них эпизоотий. Данный способ обработки предполагает внесение небольших количеств препарата. В другом случае опрыскивание или опыление производят на зараженных участках в период рождения личинок или на ранних стадиях их развития.

 

 

ТЕХНОЛОГИЯ  ПРОИЗВОДСТВА БАКТЕРИАЛЬНЫХ УДОБРЕНИЙ  НА ОСНОВЕ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТРИЙ

 

Микрофлора почвы оказывает  непосредственное влияние на её плодородие и, как следствие, на урожайность  растений. Почвенные микроорганизмы в процессе роста и развития улучшают структуру почвы, накапливают в ней питательные вещества, минерализуют различные органические соединения, превращая их в легко усвояемые растением компоненты питания. Для стимуляции этих процессов применяют различные бактериальные удобрения, обогащающие ризосферу растений полезными микроорганизмами. Микроорганизмы, используемые для производства бактериальных препаратов, способствуют снабжению растений не только элементами минерального питания, но и физиологически активными веществами (фитогормонами, витаминами и др.).

В настоящее время  выпускают такие бактериальные  удобрения, как (Россия) нитрагин, ризоторфин, азотобактерин, фосфобактерин, экстрасол, ер малхами (Узбекистан).

 Российские промышленность выпускает два вида препаратов клубеньковых бактерий: нитрагин и ризоторфин. Оба препарата производятся на основе активных жизнеспособных клубеньковых бактерий из рода Rhizobium. Эти бактерии в симбиозе с бобовыми культурами способны фиксировать свободный азот атмосферы, превращая его в соединения, легкоусвояемые растением.

Бактерии рода Rhizobium - строгие аэробы. Среди них различают  активные, малоактивные и неактивные культуры. Критерием активности клубеньковых бактерий служит их способность в  симбиозе с бобовым растением  фиксировать атмосферный азот и использовать его в виде соединений для корневого питания растений.

Фиксация атмосферного азота возможна только в клубеньках, образующихся на корнях растений. Возникают  они при инфицировании корневой системы бактериями из рода Rhizobium. Заражение корневой системы происходит через молодые корневые волоски. После внедрения бактерии прорастают внутри них до самого основания в виде инфекционной нити. Выросшие нити проникают сквозь стенки эпидермиса в кору корня, разветвляются и распределяются по клетками коры. При этом индуцируется деление клеток хозяина и разрастание тканей. В месте локализации бактерий на корне растения-хозяина образуются клубеньки, в которых бактерии быстро размножаются и располагаются по отдельности или группами в цитоплазме растительных клеток. Сами бактериальные клетки увеличиваются в несколько раз и меняют окраску. Если клубеньки имеют красноватую или розовую окраску, обусловленную наличием пигмента легоглобина (леггемоглобина) - аналог гемоглобина крови животных, то они способны фиксировать молекулярный азот. Неокрашенные ("пустые") или имеющие зеленоватую окраску клубеньки не фиксируют азот.

Бактерии, находящиеся  в клубеньках, синтезируют ферментную систему с нитрогеназной активностью, восстанавливающую молекулярный азот до аммиака. Ассимиляция аммиака происходит, в основном, путем вовлечения его в ряд ферментативных превращений, приводящих к образованию глутамина и глутаминовой кислоты, идущих в дальнейшем на биосинтез белка.

Помимо критерия активности в характеристике клубеньковых бактерий используют критерий вирулентности. Он характеризует способность микроорганизма вступать в симбиоз с бобовым растением, то есть проникать через корневые волоски внутрь корня и вызывать образование клубеньков. Большое значение имеет скорость такого проникновения. В симбиотическом комплексе растение - Rhizobium бактерии обеспечиваются питательными веществами, а сами снабжают растение азотистым питанием. С вирулентностью связана и видовая избирательность, которая характеризует способность данного вида бактерий к симбиозу с определенным видом бобового растения. Классификация различных видов Rhizobium учитывает растение-хозяина, например: Rhizobium phaseoli - для фасоли, Rhizobium lupini - для люпина, сараделлы и т.д. Вирулентность и видоспецифичность взаимосвязаны и не являются постоянными свойствами штамма.

Задачей производства бактериальных  удобрения является максимальное накопление жизнеспособных клеток, сохранение их жизнеспособности на всех стадиях технологического процесса, приготовление на их основе готовых форм препарата с сохранением активности в течение гарантийного срока хранения.

Сухой нитрагин - порошок светло-серого цвета, содержащий в 1 г не менее 9 млрд. жизнеспособных бактерий в смеси с наполнителем. Влажность не превышает 5-7%. Промышленное производство имеет типичную схему. Необходимо отметить, что важно подбирать штаммы, устойчивые к высушиванию. Для производства посевного материала исходную культуру клубеньковых бактерий выращивают на агаризованной среде, содержащей отвар бобовых семян, 2% агара и 1% сахарозы, затем культуру размножают в колбах на жидкой питательной среде в течение 1-2 суток при 28-30^оС и рН 6.5-7.5. На всех этапах промышленного культивирования применяют питательную среду, включающую такие компоненты, как меласса, кукурузный экстракт, минеральные соли в виде сульфатов аммония и магния, мел, хлорид натрия и двузамещенный фосфат калия. Основная ферментация идет при тех же условиях в течение 2-3 суток. Готовую культуральную жидкость сепарируют, получается биомасса в виде пасты с влажностью 70-80%. Пасту смешивают с защитной средой, содержащей тиомочевину и мелассу (1:20) и направляют на высушивание. Сушат путем сублимации ( в вакуум-сушильных шкафах). Высушенную биомассу размалывают.