Бактериологическое исследование молока

 
189,0 г сернокислого аммония и  29,3 натрия хлорида растворяют в 1 л бидистиллированной воды.

 
7) Приготовление молочной сыворотки.

 

Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Жир снимают с помощью шпателя, снятое молоко подогревают до 37°С и добавляют уксусную иди соляную кислоту по каплям, доводя рН до 4,6. Казеин отделяют центрифугированием, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр. Доводят рН сыворотки до 7,2-7,3 0,1н раствором едкого натра.

 
8) Построение калибровочных кривых.

 

Используют эталонные  сыворотки с известным содержанием  иммуноглобулинов классов А, G, М. К 1 мл эталонной сыворотки добавляют 1 мл физиологического раствора, тщательно перемешивают и 1 мл разведении добавляют к 1 мл физиологического раствора и т.д. до 7-й пробирки. Затем определяют оптическую плотность полученного разведения сывороток в физиологическом растворе колориметрически при длине волны 400-470 нм (синий светофильтр) и строят калибровочные кривые зависимости величины оптической плотности от концентрации иммуноглобулинов А, G, М.

Проведение анализа: 

1) Определение иммуноглобулина  G.

 
в пробирку № 1 вносят 5 мл цинк салицилового реактива, добавляют 1,1 мл молочной сыворотки, выдерживают 1 мин и колориметрируют при длине волны 400-470 мл (синий светофильтр). В пробирку № 2 вносят 6 мл тимолового реактива, добавляют 0,05 мл молочной сыворотки и колориметрируют при длине волны 400-470 нм (синий светофильтр). 

 
2) Определение иммуноглобулина М.  В пробирку № 3 вносят б мл цинкового реактива, добавляют 0.05 мл сыворотки и колориметрируют при длине волны 400-470 нм (синий светофильтр).  
3) Определение иммуноглобулина А.

 
В пробирку № 4 вносят 6 мл раствора сернокислого аммония, добавляют 0,05 мл молочной сыворотки  и колориметрируют при длине волны 400-470 нм (синий светофильтр 
Обработка результатов:

 
Для каждого класса иммуноглобулинов проводят расчет оптической плотности исследуемых растворов, а затем по калибровочной кривой с учетом этих данных определяют их количественное содержание.

 
Иммуноглобулин G.

 
ДG = Д2 х 2 + Д1

 
где ДG - оптическая плотность иммуноглобулина G;

 
Д2 - оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 2; 

 
Д1 - оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 1;

 
2 – коэффициент.

 
 
Иммуноглобулин M

 
ДM = Д3 х 2

 
где Дм - оптическая плотность иммуноглобулина;

 
Дз - оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 3;

 
2 – коэффициент.

 
 
Иммуноглобулин А.

 
Да= Д4 х 2

 
где Да- оптическая плотность иммуноглобулина А;

 
Д4 - оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 4;

 
2 - коэффициент.

 
 
Определение лактоферрина

 
В основу метода положен метод Манчини, который основан на изменении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой сыворотки молока, в луночки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована специфическая антисыворотка.

Подготовка к анализу:

 
1) Приготовление агара со специфической антисывороткой. Свежий 3% гель агар «Дифко», приготовленный на 0,033М фосфатном буфере с рН 8,0, содержащим 0,1 М поваренной соли и 0,01% мертиолята натрия, охлаждают до 52°С, смешивают с равным объемом антисыворотки, разведенной в 60 раз и нагретой до этой же температуры, и выливают на стеклянную пластину. Предварительно на пластинку помещают П-образную латунную или пластмассовую рамку толщиной 1 мм, сверху помещают вторую стеклянную пластинку, смоченную гидрофобной жидкостью, и пространство между стеклянными пластинами заливают смесью агара с антисывороткой.

 
2) Приготовление молочной сыворотки.

 

Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и молоко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший осадок казеина центрифугируют, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.

 

3) Построение калибровочного  графика.

 

Для построения калибровочного графика используют стандартный  лактоферрин в концентрациях 175, 350, 700, 1400, 2800 мкг./мл, разведенный в 0,033 М фосфатном буфере с рН 8,0, содержащим 0,1 М поваренной соли и 0,01% мертиолята натрия. 
Проведение анализа:

 

В слое агара с антисывороткой пробойникам вырезают рядами лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят с помощью микрошприца по 2 мкл разведения стандартного лактоферрина. Лунки следующих рядов заполняют исследуемыми молочными сыворотками в том же объеме. Агаровые пластины выдерживают при комнатной температуре 18-20°С во влажной среде в течение 4-3 ч, затем окрашивают амидо-черным Б.

 

Обработка результатов:

С помощью чертежного измерителя или штангенциркуля измеряют диаметры колец преципитации. Строят калибровочный  график зависимости логарифма концентрации стандартного лактоферрина в различной концентрации от квадрата диаметра колец преципитации о антисывороткой.

На полулогарифмической  бумаге по оси абсцисс откладывают  диаметры колец преципитации стандартным лактоферрином, а по оси ординат - известное количество лактоферрина, содержащееся в каждом разведении. Образующиеся точки соединяют прямой.

Определение концентрации лактоферрина в испытуемых молочных сыворотках определяют с помощью калибровочного графика.

У клинически здоровых коров  после родов и в середине лактации количество лактоферрина составляет 53-65 мкг/мл, у больных маститом - 251-330 мкг/мл, к концу лактации (период запуска) оно возрастает до 481,9±34,5 мет/мл и 2559,0±170,4 мкг/мл соответственно.

 

Определение активности лактопероксидазы

 
а) Метод Б.П. Плешкова.

Метод основан на определении  скорости реакции окисления бензидина с перекисью водорода при участии лактопероксидазы с образованием вещества, имеющего максимум поглощения при 520 нм.

Подготовка к анализу:

 
1) Приготовление 2,5 мМ раствора бензидина.

184,2 мг бензидина растворяют в смеси 100 мл дистиллированной воды и 2,3 мл ледяной уксусной кислоты. После полного растворения бензидина раствор охлаждают, растворяют в нем 5,45 г трехводного уксуснокислого натрия и доводят общий объем раствора дистиллированной водой до 400 мл.

 

2) Приготовление 0,333н перекиси  водорода.

 
К 0,6 мл перекиси водорода добавляют 99,4 мл дистиллированной воды. Концентрацию перекиси определяют титрованием 0,1н раствором перманганата калия (НКМn04). На титрование 3,0 мл 0,333н перекиси водорода должно пойти 10,0 мл 0,1н раствора перманганата калия. По результатам титрования раствор перекиси водорода доводят до нужной концентрации дистиллированной водой. 

 

3) Приготовление молочной  сыворотки.

 

 

Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и молоко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.

 
Оборудование и аппаратура:

 
1) Спектрофотометр с термостатируемой кюветой.

 
2) Секундомер.

 
3) Ультратермостат.

 
4) Бюретка для титрования.

 
5) Пробирки химические.

 
6) Весы аналитические.

 
Проведение анализа:

 

В термостатируемую кювету с рабочей длиной 10 мм наливает 2,0 мл раствора бензидина и 0,5 мл раствора перекиси водорода, предварительно подогретых до температуры 37°С. Содержимое кюветы перемешивают и устанавливают на спектрофотометре при длине волны 520 нм нулевую отметку шкалы оптической плотности. Затем в кювету добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки молока, перемешивают и ровно через 60 с (по секундомеру) определяют оптическую плотность. 
Аналогично опытной пробе проводят измерение оптической плотности контрольной пробы, содержащей вместо сыворотки молока 0,1 мл дистиллированной воды. 
Обработка результатов:

 

Активность лактопероксидазы рассчитывают по формуле и выражают в условных единицах активности (УЕА).

 
(Ео-Ек) х 10

 
УЕА = ------------------------------- ,

 
60  
 
где УЕА - активность фермента, Ед ОП/мл;

 
Ео - оптическая плотность опытной пробы;

 
Ек - оптическая плотность контрольной пробы;

 
10 - коэффициент пересчета в 1 мл;

 
60 - время проведения реакции,  с.;

 
УЕА - изменение оптической плотности  на 0,01 за 1 с одним мл сыворотки  молока.

 
 
б) Модифицированный метод Орам и Рейтер.

 
Подготовка к анализу:

 
1) Приготовление 0,1 М фосфатного  буфера, рН 6,7. 6,8 г двузамещенного фосфорнокислого калия (КН2РО4) растворяют в 500 мл дистиллированной воды и 11,4 г водного однозамещенного фосфорнокислого калия (КН2РО4 х 3Н2О) растворяют в 500 мл дистиллированной воды. В раствор двузамещенного фосфорнокислого калия под контролем рН-метра приливают раствор однозамещенного фосфорнокислого калия до установления рН 6,7.

 
2) Приготовление 0,01% раствора ортодианизидина. 10 мг орто-дианизидина растворяют в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,7.

 
3) Приготовление молочной сыворотки.

 
Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и молоко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр. 

 
Проведение анализа:

 
К 3 мл 0,01% раствора орто-дианизидина добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки молока, тщательно перемешивают и определяют экстинцию на спектрофотометре при длине волны 460 нм с рабочей длиной кюветы 10 мм. Затем в кювету доливают 0,1 мл 9 мМ перекиси водорода, хорошо перемешивают и выдерживают в водяной бане или термостате при температуре 37°С 5 мин. Снова измеряют экстинцию при той же длине волны. 
Обработка результатов:

 
Активность лактопероксидазы выражают в условных единицах активности (УЕА) и определяют по формуле:

 
До – Д5

 
УЕА = ————————,

 
5

 
где - До - начальная экстинция молока;

 
Д5 - экстинция через 5 мин;

 
5 - время инкубации образца при  температуре 37°С, мин.

 
УЕА - изменение экстинции на 0,001 единицы за 1 мин одним мл сыворотки молока.

 
В молоке клинически здоровых коров в середине лактации активность лактопероксидазы составляет 535,0±44,0 УЕ, а у больных субклиническим маститом 964,0±32,0 УЕ

 
 
1.4.Лечение животных, больных маститом.

 

 

Лечение коров при клинически выраженных маститах. Терапию осуществляют, учитывая форму, течение воспаления вымени, причины возникновения, общее состояние животного. Наиболее эффективно лечение маститов в первые дни заболевания. Необходимо соблюдать осторожность в дозировании лекарственных препаратов и применении некоторых процедур.

Во время лечения одновременно применяют две-три процедуры с  учетом их сложности и действия на организм. Постоянное наблюдение за больными животными позволяет определить эффективность терапии и в случае необходимости изменить способ лечения.

При острых маститах коров  изолируют, переводят на ручное доение, пораженные четверти выдаивают последними в отдельную посуду, секрет уничтожают, а посуду обеззараживают. С целью уменьшения секреции молока коров переводят на диету — уменьшают дачу концентрированных и сочных кормов, заменяя их доброкачественным сеном, ограничивают водопой.

Моцион коровам предоставляют  с учетом формы мастита и течении заболевания. 
Для лечения маститов у коров предложено большое количество методов, из которых наиболее эффективна патогенетическая терапия. Ветеринарный специалист должен научно обоснованно выбирать метод лечения, учитывая возможность его выполнения в данных условиях.

Физиотерапия 
Физические методы лечения предусматривают применение холода в первые сутки воспаления вымени для снижения болевой реакции, уменьшения выпота из кровеносных сосудов жидкой части крови в ткани вымени. Пораженную четверть обливают холодной водой, обмазывают жидкой глиной с уксусом (2—3 столовых ложки на 1 л воды); если глина высыхает, ее поливают холодной водой. Холод применяют не более 3—4 ч. 
Осторожное сдаивание пораженной четверти вымени, т. е. через каждые 2—3 ч, показано при всех формах мастита. Оно обеспечивает опорожнение цистерны, удаление с секретом токсических веществ и возбудителей заболевания, уменьшает внутривыменное давление, снижает болевую реакцию, что положительно влияет на процесс выздоровления. 
Массаж вымени применяют при серозном мастите снизу вверх, чтобы улучшить отток крови и лимфы, при катаральном — сверху вниз для лучшего перемещения сгустков и экссудата из молочных ходов в цистерну и выведения их из вымени при доении. Массаж способствует ускорению рассасывания воспалительной инфильтрации, активизирует нервно-рефлекторные процессы в молочной железе, улучшает обмен веществ, лимфо- и кровообращение, увеличивает приток питательных веществ к тканям. После сдаивания массаж проводят , три раза в день по 10—15 мин. При гнойном, фибринозном и геморрагическом маститах массаж вымени противопоказан. 
Если в цистерне больной четверти скопилось много труд-ноудаляемых сгустков и хлопьев, препятствующих сдаиванию, то для их разжижения вводят в вымя 40—50 мл теплого 2—3%-ного раствора соды или 1—2%-ного соле-содового раствора. Вымя слегка встряхивают и через 20—30 мин сдаивают. Не рекомендуется частое проведение катетеризаций, так как длительное раздражение воспаленной слизистой оболочки может вести к сужению сокового канала и цистерны.