Бактериологическое исследование молока

 
В качестве тест-культуры используют белый стрептококк штамм. 
Максимальные концентрации ЛК в молозиве, через 10 дней после отела его уровень ниже уровня ЛМ.

 
г) «Лизоцим термостабильный» - ЛТ 

 
В качестве тест-культуры используют золотистый стафилококк штамм ВМ-57. 
Выявляется в молоке стародойных коров после прогревания при температуре 70°С в течение 30 мин и сохраняется до 1,5-2,0 мес., в сыром молоке сохраняется 5-7 дней

 
д) «Лизоцим инверсионный» - ЛИ 

 

В качестве тест-культуры используют розовый стафилококк штамм 56. 
Отсутствует в молоке здоровых коров, обнаруживается в секрете пораженных маститом долей вымени.

 
е) «Лизоцим основной» - ЛО

 

В качестве тест-культуры используют ацидофильную палочку штамм 17 т. Определяют методом серийных разведении. В разведения молока (молозива) вносят в объеме 10% суточную бульонную тест-культуру, выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение суток, после чего учитывают рост. 
В молозиве ЛО действует бактерицидно в разведении 1:10 000, на 10-й день после отела в молоке его антибактериальное действие проявляется в разведении 1:2-1:4, а у больных маститом коров ЛО несколько повышается.

Определение истинного лизоцима (мурамидазы)

 
а) Метод К. Шахани.

Подготовка к анализу: 

 
1) Приготовление молочной сыворотки.

5 мл молока разводят  равным объемом 0,5% раствора натрия  хлорида и центрифугируют 10 мин  при 2000 об/мин. Снимают слой  жира, молоко подогревают до 37°С и доводят рН до 4,6 1н раствором соляной кислоты. Выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр.

2) Построение калибровочных  кривых. Для построения калибровочных  кривых используют кипяченое  молоко, в котором таким способом подавляется лизоцимная активность, а затем из него готовят молочную сыворотку. 
В качестве тест-культуры используют убитых ультрафиолетовыми лучами и лиофилизированных клеток Мусгососсus 1уsоdеiсticus, из которых готовят суспензию на 1/15 М фосфатном буфере с рН 6,2, экстинция которых должна составлять 10-30% против дистиллированной воды (100%).

В два ряда пробирок с  сывороткой молока по 3 мл вносят разные количества лизоцима (в первый ряд - от 0-20 мкг/100 мл, во второй - от 20-200 мкг/100 мл), затем добавляют по 3 мл свежеприготовленной клеточной суспензии тест-культуры и на спектрофотометре определяют экстинцию (Д0) при длине волны 540 нм. После этого смесь инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 20 мин и повторно определяют экстинцию (Д20). По разности экстинций (Д0 и Д20) смеси отдельных пробирок и соответствия ей концентрации лизоцима строят две калибровочные кривые. 

Проведение анализа:

 
К 3 мл сыворотки исследуемого молока добавляют 3 мл свежеприготовленной клеточной суспензии тест-культуры и сразу же определяют на спектрофотометре экстинцию (Д0) при длине волны. 540 нм. Затем смесь инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 20 мин и повторно определяют экстинцию (Д20). 
По разности экстинций Д0 и Д 20 по калибровочной кривой определяют концентрацию лизоцима.  
 
б) По методу Парри в модификации Хавигера

 
1) Приготовление молочной сыворотки.

 
5 мл молока центрифугируют 10 мин  при 2000 об/мин, снимают слой  жира, подогревают до 37°С и осаждают казеин, доводя рН до 4,6 путем внесения 1н раствора соляной кислоты. Казеин отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр и разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1.

 
2) Приготовление суспензии тест-культуры.

 

Используют ацетоновый порошок  убитой культуры Мусгососсus 1уsоdеiсticus, который вносят в 1/5 М фосфатный буфер с рН 6,2 до конечной оптической плотности 0,65-0,70, которая не изменяется при комнатной температуре в течение 30 мин. 
К 1 мл суспензии тест-культуры добавляют 1 мл разведенной физиологическим раствором сыворотки молока, быстро перемешивают и измеряют оптическую плотность Д0 на спектрофотометре при длине волны 540 нм в кювете с рабочей длиной 1 см. Затем пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 30 мин, после чего снова определяют оптическую плотность (Д30).

Активность лизоцима выражают в условных единицах активности (УЕА) и определяют по формуле:

 

Д0-Д30 
УЕД = ——————,

 
30 

где Д0 - начальная оптическая плотность образца;

 
Д30 - оптическая плотность через 30 мин;

 
30 - время инкубации образца в  термостате, мин.

 
1 УЕА - изменение оптической плотности  на 1 единицу за 1 мин одним мл  сыворотки молока.

По данным Н.А. Сапожниковой (1992), в молоке клинически здоровых коров активность мурамидазы составляет 0,56±0,02 УЕ, а больных субклиническим маститом - 0,46±0,01 УЕ.

 

в) Метод П. А. Емельяненко и др.

 
1) Приготовление агаровых пластинок.

 
1% раствор агара «Дифко» на 1/15 М фосфатном буфере расплавляют 15-20 мин на кипящей водяной бане. В охлажденный до 60-70°С раствор вносят ацетоновый порошок тест-микроба Мусгососсus 1уsоdеiсticus из расчета 20 мг на 100 мл среды и перемешивают до получения однородной смеси. Смесь разливают в прямоугольные кюветы из органического стекла размером 30х17х1,5 см так, чтобы получился слой агара толщиной 4 см. После застывания в агаре с помощью тонкостенной металлической трубочки с наружным диаметром 5 мм делают луночки на расстоянии 1,5 см друг от друга.

 
2) Приготовление обезжиренного молока. 

 
Пробу молока (2-5 мл) выдерживают в  холодильнике при температуре 4-6°С в течение 12-14 ч и снимают верхний слой с жиром.

 
3) Приготовление растворов лизоцима.

 
Стандартный лизоцим разводят в 1/15 М фосфатном буфере до концентрации 1, 3, 5, 10, 20, 40 и 70 мкг/мл.

Растворы стандартного лизоцима и пробы молока вносят в луночки  агаровой пластинки в количестве по 0,05 мл. Кюветы с образцами выдерживают 48 ч во влажной камере при комнатной  температуре 22-24°С и линейкой измеряют диаметры зон лизиса. 
Обработка результатов:

По данным зон лизиса растворами стандартного лизоцима строят калибровочную  кривую в полулогарифмическом масштабе и с ее помощью определяют концентрацию лизоцима в исследуемых пробах молока.

 

г) Метод Оссермана в модификации Фараджи 

 
Подготовка к анализу: 

1) Приготовление агаровых  пластинок. 

1% раствор агара «Дифко» на 1/15 М фосфатном буфере рН 6,2 расплавляют 15-20 мин на водяной бане. В охлажденный до 60~70°С раствор вносят ацетоновый порошок тест-культуры Мусгососсus 1уsоdеiсticus из расчета 50 мг на 100 мл среды и перемешивают до получения однородной смеси. Смесь разливают в чашки Петри так, чтобы получился слой агара толщиной 4 мм. После застывания агара в нем делают луночки диаметром 1 см на расстоянии 1,5 см друг от друга.

 
2)Приготовление обезжиренного молока.

Пробу молока (2-5 мл) выдерживают  в холодильнике при температуре 4-6°С в течение 24 ч, снимают верхний слой с жиром и разводят 1/15 М фосфатным буфером в соотношении 1:10.

3) Приготовление растворов  лизоцима.

 
Стандартный лизоцим разводят в 1/15 М фосфатном буфере до концентрации 1, 3, 5, 10,

20, 40 и 70 мкг/мл.

Растворы стандартного лизоцима и пробы разведенного молока вносят в луночки агаровой пластинки  в количестве по 0,1 мл, выдерживают в термостате при 37°С в течение 36 ч и линейкой измеряют диаметры зон лизиса.

По данным зон лизиса растворами стандартного лизоцима строят калибровочную  кривую и с ее помощью определяют концентрацию лизоцима в исследуемых  пробах молока. 
 
Определение общих иммуноглобулинов

 
 
Методом с сульфатом натрия

 
Подготовка к анализу 

 
1) Приготовление молочной сыворотки.  Пробу молока (молозива) центрифугируют  в течение 30 мин при 3000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира, который легко отделяют проволочной петлей или шпателем. Обезжиренное молозиво разводят дистиллированной водой в 5-10 раз, подогревают до температуры 37°С и добавляют по каплям 10% раствор уксусной кислоты, доводя рН до 4,6, для осаждения казеина. Полученную сыворотку молока (молозива) фильтруют через бумажный фильтр и используют для анализа.

 
2) Приготовление 18% раствора сульфата  натрия.

 
18 г обезвоженного сульфата натрия  растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в посуде с притертой крышкой. 
В пробирку вносят 1,9 мл 18% раствора сульфата натрия, добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки молока (молозива), тщательно перемешивают и колориметрируют на ФЭКе при длине волны 400±5 нм (синий светофильтр № 3) в кювете с рабочей гранью 5 мм относительно чистого раствора сульфата цинка. В случае получения оптической плотности выше отметок 1,300-1,500 сыворотку разбавляют физиологическим раствором в 2-3 раза. Степень разведения учитывают при расчете конечных результатов.  
 
а) Метод радиальной иммунодиффузии

 
В основу метода положен метод Манчини, который основан на измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой молочной сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого иммуноглобулина. Содержание иммуноглобулинов определяют относительно стандартной сыворотки с известной концентрацией иммуноглобулинов.

 
Подготовка к анализу: 

 
Приготовление агара с моноспецифической антисывороткой к иммуноглобулинам классов А, G, М.

3% агар «Дифко» или агарозу на 0,1 М веронал-мединаловом буфере с рН 8,6 смешивают нагретым до температуры 56°С в соотношении 1:1 с моноспецифической антисывороткой, в которой концентрация антител вдвое превышает рабочий титр (указанный на этикетке). Разведения антисыворотки делают на 0,1 М веронал-мединаловом буфере с рН 8,6. Агар, смешанный с моноспецифической антисывороткой, распределяют равномерным слоем на стеклянных пластинках размером 9х12 см. Для этого на пластинку помещают латунную иди пластмассовую П-образную рамку толщиной 1 мм, сверху помещают вторую стеклянную пластинку, смоченную гидрофобной жидкостью, и пространство между пластинками заливают смесью агара и антисыворотки в количестве 9 мл.

Приготовление молочной сыворотки:

 
Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 80-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и центрифугат нагревают до 37°С. Затем по каплям добавляют 10% раствор уксусной кислоты, доводя рН до 4,6 для осаждения казеина. Казеин осаждают центрифугированием, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр.

Проведение анализа:

В слое агара с моноспецифической антисывороткой пробойником вырезают рядом две лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят с помощью микрошприца по 2 мкл стандартной не разведенной и разведенной 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 моноспецифической сыворотки. Лунки следующих рядов заполняют испытуемой молочной сывороткой объемом по 2 мкл. Пластинки инкубируют во влажной камере в течение 24 ч при температуре 4°С, а пластинки с антисывороткой - к иммуноглобулину М-48 ч.

 
Обработка результатов:

После окончания инкубации  измеряют диаметр колец преципитации. По данным разведении стандартных сывороток строят калибровочные кривые, выражающие зависимость между концентрацией иммуноглобулинов и диаметром колец преципитации. Для этого на полулогарифмической бумаге по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципитации стандартной сыворотки, а по оси ординат - известное количество иммуноглобулинов (МЕ/мл или мг/мл), содержащиеся в стандартной сыворотке каждого разведения. Образующиеся точки соединяют прямой линией. Для каждого класса иммуноглобулинов строят отдельный график.

Для определения уровня иммуноглобулинов в испытуемой молочной сыворотке на оси абсцисс откладывают диаметр кольца преципитации, затем восстанавливают перпендикуляр до пересечения с кривой и точку пересечения проектируют на ось ординат. Полученное значение соответствует концентрации иммуноглобулина каждого класса, выраженной в МЕ/мл или мг/мл.

По данным Н.А. Сапожниковой (1992), концентрация иммуноглобулинов класса G в молоке клинически здоровых коров составляет: после родов - 7,9710,31 мг/мл, в середине лактации - 1,78+0,09 мг/мл, в период запуска - 8,28+0,38 мг/мл, у больных субклиническим маститом - 15,02+0,87,2,56+0,09 и 11,87+0,59 мг/мл, иммуноглобулинов класса М соответственна 0,3й±0,03, 0,14±0,01, 0,34±0,04 мг/мл и 0,53+0,04, 0,23+0,01 и 0,39±0,05 мг/мл. 
 
б) Химический метод по Бадин и Раусселет.

 
1) Приготовление цинк-салицилового реактива.

 
1,875 сульфата цинка растворяют  в бидистиллированной воде, вносят 57,14 г салицилового натрия, доливают водой до 900-950 мл. Измеряют рН, доводят 0,1н раствором едкого натра до 7,3, после доводят раствор до 1 л в мерной колбе бидистиллированной водой.

 
2) Приготовление раствора кальция  хлорида.

 
2 мл официального 10% раствора кальция  хлорида (фиксанола) смешивают с 117 мл бидистиллированной воды.

 
3) Приготовление тимолового реактива.

 
Сначала готовят 10% раствор тимола на 96° спирте. Затем 1 мл спиртового раствора растворяют в 80 мл веронал-мединалового буфера, встряхивают и .доводят до 100 мл. 
4) Приготовление веронал-мединалового буфера.

2,76 г веронала растворяют  в 1-литровой колбе в небольшом  количестве бидистиллированной воды, затем прибавляют 2,06 г мединала, после растворения определяют рН и доводят вероналом или мединалом до 7,5, раствор доводят до метки 1 л бидистиллированной водой.

 

5) Приготовление цинкового  реактива.

 
0,28 г веронала, 0,21 г мединала и 0,024 г сульфата цинка растворяют в 1 л бидистиллированной воды, доводят до рН 7,5 вероналом или мединалом. 
6) Приготовление раствора сернокислого аммония.