Бактериологическое исследование молока

При микроскопии имеют  шарообразную форму и располагаются  в виде гроздевидных скоплений, тетрами или одиночно. По Грамму красятся положительно. 
ДНК-азная активность. Выделение золотистого стафилококка ускоренным методом и определение ДНК-азной активности проводят с использованием элективной, дифференциально-диагностической среды ДНК-новокаинового агара (рецепт 2). 
Элективные свойства среды обусловлены ингибирующим действием на постороннюю микрофлору новокаина, дифференцирующие - наличием ДНК, позволяющей идентифицировать золотистый стафилококк по его дезоксирибонуклеазной активности. 
Готовят разведение исследуемых проб молока, (секрета) на стерильном физиологическом растворе 1:10 и 1:100. В чашку Петри с ДНК-новокаиновым агаром вносят 0,1 мл молока (секрета) в разведении 1:100 и равномерно распределяют стерильным стеклянным шпателем по всей поверхности питательной среды. Засеянные чашки помещают в термостат крышками вниз и инкубируют при 37-38°С в течение 22-24 ч. Для выделения ДНК-азной активности золотистого стафилококка поверхность среды в чашках с выросшими культурами заливают 5-7 мл 1н раствора соляной кислоты. Чашки с кислотой выдерживают 2-3 мин, затем кислоту сливают и учитывают результаты, просматривая чашки в проходящем свете.

При выделении культуры стафилококка на кровяном агаре и наличии изолированной чистой культуры ДНК-азная активность может быть определена путем посева на ДНК-агар (рецепт 3).

На ДНК-новокаиновом агаре золотистый, стафилококк растет в виде крупных круглых колоний с ровными краями, окруженных зоной просветления с четкими границами.

Для определения количества золотистого стафилококка в 1 мл исследуемого молока (секрета) подсчитывают колонии  с зоной просветления по всей поверхности среды и полученное число колоний умножают на 10 (брали 0,1 мл материала) и на 100 (степень разведения).  
Каталазная активность. На предметное стекло наносят каплю 10% перекиси водорода и в ней растирают внесенную бактериологической петлей чистую культуру микроорганизмов. 
При положительной реакции на каталазу происходит интенсивное газообразование которое проявляется вспениванием капли перекиси водорода. Фермент каталазу содержат стафилококки и микрококки.

Реакция плазмокоагуляции (РПК). Культуру стафилококка высевают в пробирки с мясо-пептонным бульоном и через 3 ч после выращивания в термостате при температуре 37°С используют для постановки РПК с цельной или сухой плазмой крови кролика. Для этого плазму разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:5 и разливают в аглютинационные пробирки по 0,5 мл. Бульонную культуру стафилококка по 0,1 мл (2 капли) вносят в пробирки с разведенной кроличьей плазмой. Для контроля в одну пробирку с плазмой не вносят культуру, а в другую засевают заведомо плазмо-аглютинирующий стафилококк. Пробирки помещают в термостат при температуре 37°С и через каждый час в течение 3ч, 18 и 24 ч учитывают результаты.

При положительной реакции  РПК образуется сгусток, который  не выпадает из пробирки при наклоне  или плавает в плазме.

Золотистый стафилококк  является плазмокоагулируюшим.

Ферментация манита в анаэробных условиях. Суточную бульонную культуру стафилококка в количестве 0,2 мл (3-4 капли) высевают в пробирку с 0,15% полужидким агаром, содержащим 0,15% манита и индикатор Андраде, под вазелиновым маслом (рецепт 4). Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С. Результаты учитывают через каждые 24 ч, а окончательный результат - через 5 сут.  
Появление розового окрашивания (изменение цвета индикатора) указывает на ферментацию манита в анаэробных условиях, что является дифференцирующим признаком для золотистого стафилококка.

б) Выделение стрептококков 

 
Рост на 5% кровяном МПА. Колонии мелкие, росинчатые, образуют зону гемолиза α и β, смешанную или она отсутствует. При микроскопии имеют шарообразную, бобовидную форму и располагаются в виде коротких или длинных цепочек. 
Рост на среде Карташовой (рецепт 5). В пробирку со средой вносят 1 мл исследуемого молока или пересевают выросшие на кровяном агаре росинчатые колонии и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч. 
Из пробирок с измененным цветом среды делают мазки, окрашивают по Грамму и проводят микроскопию на предмет обнаружения стрептококков. 
Каталазная активность. Проводится аналогично как для стафилококков. 
Стрептококки не содержат фермент каталазу, поэтому с перекисью водорода дают каталазоотрицательную реакцию.

 
Устойчивость к желчи.

Предварительно культуру стрептококков выращивают в мясо-пептонном бульоне (МПБ) с I% глюкозы (рецепт 6), а затем вносят 1 мл культуры в пробирки с 5 мл МПБ, содержащего 40% желчи (рецепт 7) и ставят в термостат при температуре 37°С на 24 ч.  
Полное просветление бульона указывает на лизис культуры, помутнение - на рост. 
Рост в МПБ с рН 9,б. 1мл бульонной культуры стрептококков, выращенных на МПБ с глюкозой (рецепт 6), вносят в пробирку с 5 мл МПБ и рН 9,6, инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч.

 
Обесцвечивание среды указывает  на наличие роста стрептококков, восстанавливающих своими окислительно-восстановительными ферментами метиленовый синий. 
Этим свойствам обладают стрептококки серологических групп D и N. (по Ленсфильд). 
КАМП-тест. Основан на том, что стрептококки групп В при выращивании на кровяном агаре, содержащем стафилококковый β-токсин, образуют дополнительную, ясно выраженную зону гемолиза эритроцитов барана, крупного рогатого скота. 
Суточную бульонную культуру β-гемолитического стафилококка высевают на 5% кровяной агар сплошной линией по диаметру чашки Петри. Перпендикулярно к линии посева стафилококка, не доходя 5-6 мм, высевают ровным штрихом испытуемую культуру стрептококков. На одной чашке можно проверить 8-10 культур. 
КАМП-тест считают положительным, если четко выражена зона гемолиза испытуемого стрептококка в виде усеченного треугольника или полукруга в зоне β-гемолитического стафилококка. Наиболее ярко эта зона проявляется после выдержки чашек в холодильнике в течение 18-84.

 
в) Выделение бактерий группы кишечной палочки (БГКП).

Образцы молока или колоний  с кровяного агара, морфологические свойства которых напоминают БРКП, высевают на среду КОДа (рецепт 9) и помешают в термостат при температуре 35°С на 24 ч.

Изменение цвета среды  из фиолетового в зеленый свидетельствует о наличии ВГКП. 
Идентификацию эшерихий, бактерий рода энтеробактер от сальмонелл и протея проводят на среде Олькеницкого (рецепт 10). Со среды КОДа зеленого цвета посев на среду Олькеницкого в пробирках проводят бактериологической петлей на поверхность скоса среды и внутрь столбика. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч.

Изменение цвета (глюкоза+, лактоза+) скоса и столбика среды из красного в желтый при отсутствии почернения внутри свидетельствует о росте бактерий группы эшерихий. 
Изменение скоса среды и столбика в малиновый цвет (мочевина+) и почернение внутри столбика (сероводород+) указывает на рост протея.

Изменение скоса в красный, столбика в желтый и почернение внутри столбика указывает на рост сальмонелл.

г) Выделение синегнойной  палочки.

 

Бактерии этой группы при  росте на питательных средах вырабатывают сине-зеленый пигмент - пиоцианин за счет которого происходит окрашивание этих сред. 
Образцы молока или колоний с кровяного агара, при микроскопии которых обнаружены грамотрицательные палочки, высевают на МПА и МПБ, культивируют в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 ч, дополнительно до 72 ч.

Появление сине-зеленого окрашивания  МПБ и МПА, роста гладких плоских  колоний с ровными или изрезанными  краями указывает на рост синегнойной  палочки, вырабатывающей пигмент пиоционин.

Из МПБ и МПА делают мазки, окрашивают по Грамму и просматривают  под микроскопом. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек и изменении цвета сред в сине-зеленый ставят реакцию для обнаружения пиоционина. 

Определение пиоционина. В пробирку с МПБ добавляют 1 мл хлороформа, пробирку встряхивают.  
При положительной реакции хлороформ приобретает зеленый цвет и опускается на дно пробирки. 
У пигментообразующих сапрофитных бактерии в хлороформе пигмент не растворяется.  
 
д) Выделение грибов рода Саndida

 

Пробы молока в количестве по 0,1-0,3 мл высевают на 2 чашки Петри  с элективной дифференциально-диагностической  средой (рецепт 11), равномерно распределяя  материал по поверхности стерильным шпателем. Засеянные чашки помещают в термостат вверх дном при  температуре 37°С на 18-20 ч.

Контролем служит посев культуры этого гриба на ту же самую элективную дифференциально-диагностическую среду. 

После инкубации чашки  Петри просматривают, из подозрительных колоний делают мазки, окрашивают их по Грамму или другими методами, а также делают посев на ту же самую среду для выделения чистой культуры и выявления псевдомицелия. Засеянные пробирки выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч, затем выдерживают при комнатной температуре 2 суток.

Первичный учет делают через 21-24 ч после инкубации материала, а окончательный - на 4-й день исследования.

Колонии грибов рода Саndida гладкие, морщинистые, плоские, беловато-серые, кремо-беловатые, кремовые, мягкой консистенции, кожистые. 

При микроскопии обнаруживают псевдомицелий, а также почкующиеся клетки (споры, истинный мицелий, -иногда хламидоспоры).

Схема идентификации кокковой микрофлоры молока по В.Д. Парикову, В.И. Сдободянику и др.

 

Пробы молока (секрета) высевают на секторы (4,8) кровяного МПА в  чашках Петри, выдерживают в термостате 24 ч при температуре 37°С, учитывают характер роста и вид гемолиза. Из колоний, характерных для кокковых микроорганизмов, делают посев на секторы (8) кровяного МПА для получения чистых культур. Из других колоний делают мазки, красят их по Грамму и микроскопируют. Чашки Петри с отсеянными микроорганизмами инкубируют в термостате при температуре 37°С 24 ч.  
Выросшие чистые культуры кокковых микроорганизмов проверяют на каталазу с 3% перекисью водорода на предметном стекле, а также готовят мазки, красят по Грамму и микроскопируют. Каталазоположительные микроорганизмы относят к стафилококкам, а каталазоотрицательные - к стрептококкам.

 

Дифференциация стафилококков

 

Учет роста на кровяном МПА, вид гемолиза, микроскопию, постановку ТОК проводят как, как описано раньше. 

Анаэробная ферментация  манита. Среду (рецепт 12) перед применением ставят в водяную баню и кипятят 10-15 мин для удаления растворенного кислорода, охлаждают до 45-50°С и вносят на дно пробирки бактериологической петлей чистую культуру стафилококка. Поверхность среды покрывают стерильным вазелиновым маслом или парафином, слоем 2 см. Пробы культивируют в термостате при температуре 37°С в течение 5 дней.

Отсутствие желтого окрашивания  или пожелтение только поверхности среды свидетельствует об отсутствии анаэробной ферментации манита. 

Анаэробная ферментация  глюкозы. Используют среду, приготовленную по рецепту 12, в котором применяют глюкозу вместо манита, и проводят исследование по аналогичной схеме.

 
б) Дифференциация стрептококков

 

Каталазоотрицательные культуры кокковых микроорганизмов проверяют по КАМП-тесту на среде с эскулином (рецепт 13) по схемам.

Проводят по наличию просветления в зоне β-гемолиза - гемолитического стафилококка и по цвету колоний. Около 5% штаммов Str. agalactiae дают КАМП тест отрицательный и около 30% штаммов Str. uberis дают КАМП тест положительный.

Определение бактериальной  обсемененности молока редуктазным методом. Метод основан на восстановлении метиленового голубого окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По продолжительности обесцвечивания метиленового голубого оценивают бактериальную обсемененность молока.

1) Приготовление основного  спиртового раствора метиленового  голубого. 
10 г метиленового голубого смешивают со 100 мл 96% раствора этилового спирта, ставят в термостат при температуре 37°С на 24 ч, фильтруют в термостате при той же температуре.

Приготовление рабочего раствора метиленового голубого.

Основной раствор помещают в водяную баню при температуре 45°С на 5-10 мин, перемешивают до полного растворения кристаллов. Затем быстро охлаждают до температуры 20°С и 5 мл этого раствора прибавляют к 195 мл дистиллированной кипяченой воды. Смесь хорошо перемешивают. Хранят рабочий раствор при температуре 8-10°С не более 7 суток. 

В пробирку наливают 1 мл рабочего раствора метиленового голубого и 20 мл исследуемого молока, закрывают стерильной резиновой пробкой и смешивают путем медленного переворачивания пробирки. Пробирку помещают в редуктазник с температурой воды 37°С, или водяную баню, или термостат. Вода в редуктазнике или водяной бане после погружения пробирок с молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Температуру воды 37°С поддерживают в течение всего времени определения. Момент погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа.

Наблюдение за изменением окраски проводят через 20 мин, 2 ч  и 5 ч 30 мин. Окончанием анализа считают  момент обесцвечивания окраски молока. При этом оставшийся кольцеобразный окрашенный сдой вверху и внизу шириной  не более 1 см в расчет не принимается. Появление окрашивания молока в  этих пробирках при встряхивании не учитывают.

В зависимости от продолжительности  обесцвечивания молоко относят к одному из четырех классов по бактериальной обсемененности.

 

Определение ингибирующих веществ  в молоке

 

Ингибирующими веществами, попадающими в молоко, чаще всего  могут быть антимикробные и дезинфицирующие средства. Первые выделяются молочной железой при различных способах применения больным.животным, в том числе и при интрацистернальном введении. Вторые попадают в сборное молоко в результате недостаточного отмывания проточной водой доильного оборудования и молочной посуды. 
а) С индикатором резазурином.