Бактериологическое исследование молока

Метод основан на восстановлении резазурина при развитии в молоке чувствительного к ингибирующим веществам микроба вида Stгерtососсus thermophilus. 
Приготовдение коллекционной тест-культуры:

В пробирку с 10 мл стерильного  обезжиренного молока вносят одну петлю  культуры Stгерtососсus thermophilus и выдерживают в термостате при температуре 42-43°С в течение 16-18 ч. Коллекционную тест-культуру хранят при температуре 6-8°С и перевивают через 10-14 суток.

 

Приготовление рабочей тест-культуры:

В пробирку с 10 мл или баночку  со 100 мл обезжиренного молока вносят соответственно 1 петлю или I мл коллекционной тест-культуры и выдерживают в термостате при температуре 42-43°С в течение 16-18 ч. 
Проведение анализа: 

Для анализа используют 1-2-суточную рабочую тест-культуру при условии  хранения ее в холодильнике при температуре 6-8°С. 

В чистые пробирки наливают по 10 мл исследуемого молока и закрывают  стерильными резиновыми пробками. Оставшуюся часть пробы молока сохраняют в холодильнике при температуре 6-8°С. Одновременно проводят контрольный анализ. Для этого в пробирку наливают 10 мл молока, свободного от ингибирующих веществ. Это молоко можно хранить в холодильнике при температуре 6-8°С не более суток. Пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой нагревают в водяной бане до 85-90°С, выдерживают 10 мин. затем охлаждают до 43-45°С. После этого в пробирки стерильной пипеткой вносят по 0,3 мл рабочей тест-культуры. Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем трехкратного переворачивания и выдерживают при температуре 42-43°С в редуктазнике или водяной бане в течение 2 ч. После этого во все пробирки вносят по 1 мл 0,05% раствора резазурина с температурой не ниже 18-20°С. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой выдерживают в редуктазнике или водяной бане при температуре 42-43°С в течение 15 мин.

 
Учет результатов:

При отсутствии в молоке ингибирующих веществ (и в контрольной пробе) содержимое, пробирок будет иметь розовый или белый цвет.  
При наличии в молоке ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь сине-стальную, сине-фиолетовую иди фиолетовую, окраску.

Чувствительность метода позволяет обнаружить в молоке содержание пенициллина более 0,01 МЕ/мл, формалина  около 0,005%, перекиси водорода, более 0,01%

б) С индикатором метиленовым  голубым

Метод основан на восстановлении метиленового голубого при развитии в молоке чувствительных к ингибирующим веществам микроорганизмов вида Stгерtососсus thermophilus. 
Готовят коллекционную и рабочую тест-культуру. 

Приготовление 3% водного  раствора пептона. Проводят по рецепту 14. 
Приготовление 0,5% раствора метиленового голубого. 500 мг метиленового голубого помещают в колбу, доливают до 100 мл дистиллированной кипяченной водой, перемешивают до полного растворения, плотно укупоривают и хранят в холодильнике при температуре 6-8°С не более 30 суток.

Приготовление смеси для  анализа: 

К 20 мл 3% водного раствора пептона добавляют 3,5 мл односуточной культуры термофильного стрептококка (пипетку предварительно следует хорошо ополоснуть этой смесью) и 0,1 мл 0,5% водного раствора метиленового голубого. Смесь хороша перемешивают. Смесь готовят перед анализом.

Проведение анализа:

В чистые пробирки наливают по 10 мл исследуемого молока и закрывают (неплотно) резиновыми пробками. Оставшуюся часть пробы хранят в холодильнике при температуре 6-7°С в течение суток. Пробирки с молоком нагревают в водяной бане до температуры 85-90°С и выдерживают 10 мин, затем охлаждают до 42-45°С. После этого в пробирки вносят стерильной пипеткой по 2 мл приготовленной смеси, перемешивают путем трехкратного переворачивания пробирок и выдерживают в водяной бане при температуре 41-42°С в течение 1 ч 40 мин - 2 ч 20 мин.

Учет результатов:

При отсутствии в молоке ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь белый цвет.

При наличии в молоке ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь голубой цвет. Голубое кольцо, образующиеся в пробирке на поверхности молока высотой 1 см, не учитывают.

Чувствительность метода позволяет обнаружить пенициллин от 0,01 до 0,1 МЕ/мл, стрептомицин от 30-50 мкг/мл, тетрациклин, окситетрацикдин -1 МЕ/мл, олеандомицин -10 МЕ/мл, формалин - от 0,003 до 0,005%, перекись водорода от 0,01 до 0,1%. 

 
1.2.Рецепты питательных сред

 
Рецепт 1

 
Кровяной агар цитратный

 
От здоровой коровы из яремной вены берут 250 мл крови в стерильную колбу  с 50 мл стерильно приготовленного 5% раствора лимоннокислого натрия. По мере взятия кровь в колбе смешивают  с лимоннокислым натрием. Полученную цитратную кровь проверяют на стерильность путем посева на МПБ  и только после этого используют для приготовления кровяного  агара, цитратную кровь можно сохранять в течение 10-15 дней в холодильнике. МПА расплавляют в колбе, затем охлаждают до 45°С и стерильной пипеткой вносят в него 10-15% цитратной крови, равномерно смешивая, после чего разливают в чашки Петри по 15 мл. Застывший агар помещают в термостат при температуре 37°С на 24 ч для проверки на стерильность.  
Для приготовления кровяного агара можно использовать дефибринированную кровь барана.

 
Рецепт 2

 
ДНК-новокаиновый агар

 

К 150 мл расплавленного стерильного  З% МПА (рН 8,6) добавляют 150 мг ДНК-натриевой соли, предварительно растворенной в 10 мл (подщелоченной 2 каплями 10% едкого натра) дистиллированной воды, 1 и 3 мл 2% раствора новокаина. После перемешивания среду прогревают в течение 30 мин в кипящей водяной бане. К остывшей до 45-50°С среде добавляют 7-8 мл 5% сыворотки крови крупного рогатого скота и 1,2 мл 10% стерильного раствора хлористого кальция, перемешивают и разливают в чашки Петри.

 
Рецепт 3

 
ДНК-агар

 
К 150 мл расплавленного 2% МПА (рН 8,6) добавляют 150 мг ДНК-натриевой соли, растворенной в 10 мл дистиллированной воды (подщелоченной 2 каплями 10% едкого натра). Среду прогревают 30 мин в кипящей водяной бане, затем охлаждают до 50-60°С и добавляют 1,2 мл 10% стерильного раствора хлористого кальция и 13-14 мл (8-9%) сыворотки крови крупного рогатого скота или 8 мл (5%) дрожжевого экстракта.

 
Рецепт 4

 
Среда Гисса с манитом

 
Приготовление индикатора Андраде:

 
0,5 г кислого фуксина растворяют  в 100 мл стерильной дистиллированной  воды, добавляют 16,4 мл 1н едкого  натра, стерилизуют при 100°С 5 мин, хранят в темном месте с притертой пробкой.

К полужидкой пептонной среде (I% пептона, 0,5% хлорида натрия, 0,15%. агар-агар) с рН 7,4 после ее расплавления добавляют 0,5% манита и I% индикатора Андраде, перемешивают, разливают в пробирки по 10 мл. Стерилизуют при 0,5 атм. 30 мин, после чего наслаивают стерильное вазелиновое масло высотой 1 см.

 
Рецепт 5

 
Среда Карташовой

 
К 500 мл готового стерильного МПБ  добавляют 2,5 г лактозы, 1 мл спиртово-водного  раствора 1:100 бромкрезолпурина (после растворения 1 г порошка в 50 мл спирта добавляют 50 мл дистиллированной воды).

Колбу со средой ставят, в  холодную водяную баню, доводят да кипения и кипятят 5-7 мин. Охлаждают  среду до 50-55°С и добавляют, 50 мл сыворотки  крови и 50 Ед/мл неомицина. Среду разливают в стерильные пробирки по 5 мл.

 
 
Рецепт 6

 
Глюкозный МПБ

В 100 мл МПБ добавляют 1 г  глюкозы, среду стерилизуют при 0,5 атм. В течение 30 мин. Доводят рН среды до 7,2-7,4.

 
 
Рецепт 7

 
МПБ с желчью

 
К 90 мл стерильного МПБ (рН 7,4) добавляют асептический 10 мл стерильной бычьей желчи, перемешивают, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин. 

 
Рецепт 8

 
Молоко с метиленовым голубым

0,2 г метиленового голубого  растворяют в 20 мл горячей дистиллированной воды, пропускают через бумажный фильтр и стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин. К стерильному обезжиренному молоку добавляют I% приготовленного раствора метиленового голубого.

 
 
Рецепт 9

 
Среда КОДА

Среда выпускается промышленным способом в виде порошка (Дагестанский НИИ питательных сред) и готовится в соответствии с инструкцией.

 
Рецепт 10

 

Среда Олькеницкого

 
К 100 мл стерильного питательного агара добавляют 1 г лактозы, 0,02 г соли Мора, 0,03 г гипосульфита, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины и 0,4 мл 0,4% раствора фенолового красного.

Предварительно растворяют соль Мора с гипосульфитом в одной  пробирке с небольшим количеством  воды, а в другой - мочевину с углеводами. После растворения содержимое обеих  пробирок смешивают с агаром и фильтруют через стерильную марлю. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин. Горячую среду скашивают, оставляя столбик высотой 2 см. Среда прозрачная, имеет красный цвет с коричневым оттенком.

 
Рецепт 11

 
Элективная дифференциально-диагностическая  среда

 
для выделения грибов рода Саndida

 

18-20 г агар-агара растворяют  при кипячении в 500 мл дистиллированной воды, затем добавляют до 1 л фильтрат сусла, имеющего 6-8% карамели (солод пожаренный при 150-170°С в течение 2,5 ч). После установления рН 6,6-6,8 среду разливают в колбы и автоклавируют при 1 атм. 15 мин. для проверки стерильности среду ставят в термостат при температуре 37°С на 24 ч. Стерильную среду нагревают до 100 °С и остывшую до 47-50°С разливают в чашки Петри или пробирки. Чашки со средой хранят в холодильнике до 15-30 дней в целлофановых пакетах с целью предотвращения высыхания.

 

Рецепт 12

 

 
Среда для анаэробной ферментации  сахаров

 
Приготовление экстракта дрожжей:

25 г дрожжей растворить  в 100 мл дистиллированной воды, прокипятить 45 мин, затем после охлаждения центрифугировать при 3000 об/мин в течение 45 мин. Слить в колбу и довести до кипения. Разлить в стерильные пробирки и поставить в термостат при 37°С на 24 ч.

На 1 л дистиллированной воды внести 10 г трипсина Дифко, 1 мл экстракта дрожжей, 10 г манита (глюкозы), 2 г агар-агара и 0,04 г бромкрезолпурина, довести до кипения, затем стерилизовать в автоклаве при 0,5 атм. в течение 20 мин. Разлить в пробирки до высоты 10-12 см.

 
Рецепт 13

 
Кровяной агар с эскулином

 

В 1мл МПБ вносят 5 г хлорида  натрия, 1 г эскулина (получают из конского каштана), 20 г агар-агара.

В стерилизованную при 121°С среду в течение 15 мин с рН 7,4, охлажденную до 45-48°С, добавляют 50 мл дефибринированной крови барана, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой выдерживают в термостате при 37°С в течение 24 ч с целью просушивания и проверки стерильности. Чашки хранят в холодильнике при температуре 4-б°С и используют в течение 15 дней со дня приготовления. 
 
 
 
Рецепт 14

 
Водный раствор пептона

 

3 г пептона помещают  в колбу и доливают до 100 мл  водопроводной водой, стерилизуют при 121°С в течение 10 мин и хранят в холодильнике при температуре б-8°С в течение 30 суток.

 

Иммунологические методы исследования молока

 

Иммунологические факторы  молока определяют локальную резистентность молочной железы, ее сопротивляемость к развитию воспалительных процессов, коррелируют с фактором защиты всего организма и имеют особенности в зависимости от функционального состояния органа.

 

1.3.Определение лизоцимов молока по В.И.Мутовину

 
В основе выявления лизоцимов положен  метод диффузии в агар и образования зоны задержки роста (ЗЗР) тест-культуры микроба. На агаровую пластинку в чашке Петри наносят по 0.2 мл суточной бульонной тест-культуры и равномерно распределяют по всей поверхности. Выдерживают 20-30 мин при комнатной температуре для пропитывания агара, а затем с помощью пробойника диаметром 0,8-1 см делают 4 луночки, в которые вносят по 0,01 мл (2 капли) исследуемого молока. Чашки выдерживают при комнатной температуре (18-20°С) 30-40 мин, а затем 16-18 ч в термостате при температуре 36-38°С, после чего измеряют ЗЗР

а) «Лизоцим молока» - ЛМ

 
В качестве тест-культуры используют золотистый стафилококк штамм ВМ- 57, выделенный из молока здоровой коровы.

 
Максимальный уровень ЛМ (25 мм и  более) у здоровых коров на 2-6 месяцах  лактации, у больных - понижен (менее 18 мм) или отсутствует (0). Термостабилен, разрушается при температуре 70°С, в сыром молоке сохраняется до 10 дней при температуре 4-6°С.

б) «Лизоцим вымени» - ЛВ

 
В качестве тест-культуры используют слезный микрококк Флеминга. 
Не коррелирует с ЛМ, повышается уровень в молоке в конце лактации и у больных маститом коров. В сыром молоке сохраняется до 10 дней при температуре 4-б°С.

 

в) «Лизоцим колостральный» - ЛК