История развития учения о туберкулезе

Методы, используемые для выявления МБТ

• Рутинные: бактериоскопия мазка, бактериологический (посев на питательные среды)
• Биологические
• Автоматические системы
• Молекулярно-генетические

Биологический материал:

Из дыхательных путей:

• Мокрота
• Индуцированная мокрота
• Промывные воды бронхов (БС)
• Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛЖ)
• Промывные воды желудка.

Другие:

• Моча
• Плевральная жидкость
• Пунктат из брюшной полости
• Синовиальная жидкость
• Соскоб из стенки абсцесса
• Ткань.

ВИЧ и СПИД

• Кровь
• Кал.

Методы  бактериологической диагностики туберкулеза

Бактериологическая лаборатория  играет существенную роль в  выявлении, диагностике туберкулеза, выборе рациональных схем химиотерапии и оценке их эффективности.

Бактериологическая диагностика  включает обработку клиниического материала, микроскопическое исследование, выделение микроорганизма применение культуральных методов, идентификацию микобактерий с использованием бактериологических биохимических тестов, а также определение лекарственной чувствительности микобактерий.

Существует несколько  групп методов, используемых для  выявления МБТ в различном диагностическом материале:

• рутинные (бактериоскопия мазка, бактериологический (посев на питательные среды))
• биологические (биопроба, определение вирулентности штаммов МБТ)
• автоматические системы (MGIT, ВАСТЕС, МВ/ВасТ, ESP Culture System и др.)
• молекулярно-генетические методики (PCR, ICR, NASBA, Q-Beta и др.).

Каждый из этих методов  обладает определенной чувствительностью и специфичностью, что необходимо учитывать при клинической интерпретации полученных результатов,

1. Бактериоскопическое исследование.

Бактериоскопическое исследование мокроты с окраской мазка по Цилю-Нильсену для выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУБ) является наиболее быстрым, доступным и экономически эффективным существующих методов выявления больных туберкулезом. Оно может быть осуществлено в любой клинико-диагностической лаборатории (КДЛ) лечебно-профилактических учреждений всех уровней! Бактериоскопия мокроты представляется чрезвычайно информативной для выяснения эпидемиологической опасности пациента для окружающих, которая коррелирует с числом микобактерий в образцах. Бактериоскопическое исследование, проведенное должным образом, имеет положительную диагностическую ценность для легочного туберкулёза, более 90%. Разрешающая способность данного метода составляет 50-  тыс. микобактерий в 1 миллилитре мокроты и существенно зависит от ряда факторов: правильности сбора мокроты, подготовленности лабораторного персонала и разрешающей способности используемости микроскопов. При микроскопии мазков, приготовленных из проб, взятых в течение трех последовательных дней, результативность метода повышается на 20-23%. Однако нет необходимости использовать более проб мокроты.

Метод окраски по Цилю-Нильсену наиболее часто используется при бактериоскопическом выявлении микобактерий. Он заключается в следующем: мазки мокроты окрашивают фуксином при нагревании, затем обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают метиленовым синим. В результате микобактерия окрашиваются в малиновый цвет, а фон — в синий. Это специфическое окрашивание обусловил способностью микобактерий удерживать краситель при обработке кислотой или спиртом.

В бактериологических лабораториях, выполняющих большое количество исследований (100 и более ежедневно), используется люминесцентная микроскопия. Данный метод основан на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные красители (акридиновый оранжевый, аурамин, родамин и др.) затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. В зависимости от красителей, микобактерии туберкулеза дают четкое ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое - на темно-зеленом фоне. Метод люминесцентной микроскопии обладает большей чувствительностью, чем световая микроскопия особенно в сочетании с методом обогащения диетического материала (микроскопия осадка), поскольку люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить измененные микобактерий, утратившую кислотоустойчивость, в связи, с чем они не выявляются при бактериоскопии по Цилю-Нильсену. Мазки люминесцентной микроскопии готовят из осадка, полученного после обработки диагностического материала детергентом с последующим отмыванием либо нейтрализацией. При положительном результате бактериоскопии мазков, окрашенных флуорохромами. должна быть проведена подтверждающая микроскопия мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену

Бактериоскопическое исследование необходимо проводить очень тщательно. Обычно образец исследования; в течение 15 минут (что соответствует просмотру 300 полей зрения) чтобы сделать заключение об отсутствии или наличии КУБ в препарате. При окрашивании флюорохромами для исследования одного мазка требуется меньше времени.

Основным диагностическим  материалом для бактериоскопии на КУБ служит мокрота. Результаты бактериоскопического исследования на КУБ других биологических материалов (различных жидкостных мазков из осадка центрифугированной мочи не всегда позволяет получить достоверные результаты, поскольку в моче могут присутствовать нетуберкулезные микобактерии. Поэтому выявление КУБ в моче не всегда свидетельствует о наличии специфического процесса. В мазках из осадка промывных вод желудка и других материалов могут обнаруживаться кислотоустойчивые сапрофиты, которые легко спутать с МВТ,

Результат микроскопического  исследования позволяет сделать  заключение только о наличии и  отсутствии в препарате кислотоустойчивых бактерий. Достоверно диагноз «туберкулез» можно установить только после выделения из клинического материала культуры МБТ с помощью культурального метода и идентификации. Отрицательный результат бактериоскопического исследования не исключает диагноз «туберкулез», так как в мокроте некоторых пациентов может содержаться меньше микобактерий, чем позволяет выявить бактериоскопия.

Количество обнаруженных КУБ определяет степень тяжести  заболевания и опасности больного для окружающих. Следовательно, исследование должно быть не только качественным, но и количественным. В современных эпидемиологических и экономических условиях бактериоскопическое исследование мокроты у обратившихся в ЛПУ за врачебной помощью лиц с клиническими симптомами, подозрительными на туберкулез, является приоритетным направлением-в тактике раннего выявления данного заболевания. Возрастание роли этого метода связано также с возникновением в последние годы остропрогрессирующих форм заболевания, сопровождающихся выраженными клиническими проявлениями и обильным

2. Культуральное (бактериологическое) исследование.

Начиная со времени проведения работ Коха и до 1924 г. усилия ученых, направленные на поиск методов выделения чистых культур микобактерий туберкулеза, не имели особых успехов. В 1924 г. Левенштейн и Сумиоши установили, что кислоты и щелочи в известных концентрациях и при определенных экспозициях убивают сопутствующую микрофлору, не влияя на жизнеспособность МБТ. Этот метод при непрерывном совершенствовании стал приобретать практическое значение. В настоящее время бактериологическое (культуральное) исследование биологического материала на МБТ благодаря его высокой чувствительности (от10 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл исследуемого материала) и специфичности в сочетании с микроскопическим методом являете «золотым стандартом» в диагностике туберкулеза. Бактериологическое исследование на туберкулез выполняется в специализированных бактериологических, лабораториях противотуберкулезных диспансеров или посевных пунктах.

Материал для бактериологического  исследования собирают асептически. Перед проведением бактериологического исследования, поступившие в лабораторию пробы обрабатывают растворами кислот и щелочей с последующим центрифугированием. Это необходимо для разжижения и концентрации образца также для предотвращения контаминации, поскольку пробы мокроты вязкие по консистенции и содержат большое количество микрофлоры. Около 1 мл разжиженного и деконтаминированного клинического образ засевают в пробирки со средой и инкубируют при 37°С в течение 10 недель.

Для культивирования микобактерий используют плотные (яичные, агаровые) и жидкие питательные среды.

Яичные среды содержат цельные яйца или яичный желток, а также фосфолипиды, белки и другие ингредиенты. С целью предотвращения контаминации к среде добавляют некоторые красители, например, малахитовый зеленый, а также антибиотики. Поэтому яичные среды (Левеншейна-Йенсена, Финна), на которые культивируют микобактерий, имеют сине-зеленый цвет. Использование яичных сред позволяет получи видимый рост колоний через 18-24 дня в виде сухого морщинистого налета кремового цвета. Однако качество ингредиентов, из которых готовится среда, иногда значительно варьирует, что может влиять на воспроизводимость результатов. По сравнению с яичным и агаровые среды имеют ряд преимуществ: они готовятся из полусинтетических основ, что обеспечивает более стабильное качество и воспроизводимость результатов. Детекция роста МБТ на агаровых средах возможна через 10-14 дней. Однако агаровые среды дороже, требуют присутствия СО2 в атмосфере и инкубируются в термостате не более 1 месяца. Как правило для выделения микобактерий используется набор из двух разных питательных сред.

3. Автоматические системы.

Разработка радиометрической системы ВACT ЕС 460 (Becton Dickinson) ознаменовала собой качественный прорыв в быстрой детекции микобактерий и определении их лекарственной чувствительности. Автоматические системы, предназначенное для выявления микобактерий туберкулеза, позволяя проводить детекцию роста микобактерий в 2-3 раза быстрее, чем классические методы. Положительный результат анализа должен обязательно подтверждаться бактериоскопически. В практике бактериологических лабораторий исследование с использованием автоматических систем обязательно проводится параллельное исследованием на плотных питательных средах.

Идентификация микобактерий. Несмотря на то, что морфология колоний, наличие пигмента и ростовые характеристики дают некоторые представление о выделенном штамме микобактерий, для установления их видовой принадлежности микобактерий используют комплекс специальных лабораторных тестов. В 1970-х гг. Международной рабочей группой по таксономии микобактерий была стандартизована серия высоко воспроизводимых биохимических тестов, которые не требуют сложного технического обеспечения и могут быть проведены за несколько часов или дней. Это способность штамма микобактерий синтезировать никотиновую кислоту, восстанавливать нитраты, продуцировать уреазу, проявлять различную резистентность к антибиотикам, а также каталазную активность и термостабильность каталазы штамма МБТ. Кроме этого, для идентификации микобактерии используется набор бактериологических тестов: скорость роста на питательных средах способность микобактерий образовывать корп-фактор, пигмент, расти на яичной или простой агаровой среде при различных температурных режимах; на средах, содержащих NaCl, паранитробензойную кислоту или салициловокислый натрий.

4. Биологические методы диагностики туберкулеза

Биологическая проба (биопроба).

Биопроба является еще  одним методом выявления микобактерий. Для этого чувствительных туберкулезу животных (чаще всего морских свинок) заражают патологическим материалом, взятым от больного, и в течение 3 месяцев наблюдают за их весом, поведением, местными изменениями. Если в течение этого срока животное не погибает, его забивают. Морских свинок, забитых и погибших, обязательно вскрывают и оценивают туберкулезные изменения, произошедшие в их органах животных при развитии специфического процесса. Даже при отсутствии специфических изменений для подтверждения диагноза лимфатических узлов, легких, печени, селезенки готовят мазки, которые окрашивают по Цилю-Нильсену. Кроме того, кусочки указанных органов гомогенизируют и высевают на питательные среды. В сомнительных случаях выполняют гистологическое исследование тканей. Чувствительностъ биологического метода выявления микобактерий высока (несколько клеток МБТ на пробу). Однако в последнее время появились сообщения о том, что результат биологического исследования не всегда коррелирует с данными клинико-рентгенологического обследования.

5. Молекулярно-генетические методы

1. Полимеразная цепная реакция.

Получение более совершенных  питательных сред, разработка автоматических систем позволило сокращать сроки выявления и идентификации микобактерий. Однако они все еще остаются достаточно длительными и зависят от количества возбудителя в инфекционном материале. Современные молекулярно-генетические методы открывают в этой области значительные перспективы, так как позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью проводить выявление и типирование микобактерий в различном диагностическом материале.

Наиболее часто на практике используется молекулярно-генетический метод, в основе которого лежит принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР).

ПЦР — принципиально очень простой метод амплификации, т е. умножения нуклеиновых кислот. ( был открыт в середине 1980-х гг. Kary Mullis с соавторами (биотехнологическая компания «Cetus», США).

Метод ПЦР основан на повторении трех этапов, проходящих при разных температурных режимах: на первом этане двухцепочечную ДНК денатурнруют путем кратковременного нагрева инкубационной систем до 90-95^СС. Таким образом, две цепочки ДНК остаются в растворе в не связанном друг с другом состоянии до тех пор, пока температура не будет понижена. На следующем этапе, получившем название этапа отжига праймеров, который проходит при 40-60°С, с участками одноцепочечных молекул ДНК, фланкирующими последовательность-мишень. связываются праймеры. Это короткие участки РНК, длиной около нуклеотидов. Каждая из затравок связывается только с одной цепочкой ДНК Следующий шаг ПЦР - умножение последовательности-мишени с помощью полимеразы. Поскольку инкубационная система на этапе денатурации нагревается до 90-95^иС, в ПЦР используется термостабильная Tag-полимераза, выделенная из Thermus aquaticus. Этап достройки затравок проходит при 70-75°С. На этом заканчивается первый цикл амплификации. Далее все этапы повторяются 20-25 раз. В результате количество ДНК-мишени возрастает геометрической прогрессии.

На практике из патологического  материала, взятого от больных, при  помощи специальных метод выделяют ДНК. К ней добавляют реакционный  буфер, смесь нуклеозидтрифосфатов, праймеры, полимеразы, проводят амплификацию в программируемом термостате (термоциклере). Результат учитывают с помощью электрофореза в агарозном геле или с помощью иммобилизованных фрагментов ДНК. Присутствие последовательности-мишени свидетельствует о наличии МБТ в исследуемом образце. ПЦР позволило выявлять 1-10 бактериальных клеток в 1 мл биологического материала. Специфичность реакции - 97-98% Исследованию методом ПЦР подлежат мокрота, бронхиальный секрет, плевральная и другие жидкости, моча, периферическая и менструальная кровь, соскобы эпителиальных клеток цервикального канала.