Микробиологическая диагностика

 Микробиологическая диагностика  
Она основана на выделении из исследуемого материала возбудителя и обнаружении моноспецифического токсина. Исследуют кровь, выделения больного (содержимое желудка или промывные воды, мочу и испражнения), продукты, вызвавшие отравление, и трупный материал, почву, овощи, фрукты, воду и пр. Возбудители обнаруживаются с помощью посевов на среды, а токсин — биологической пробой и реакцией нейтрализации на животных. Для освобождения от сопутствующей микрофлоры одну часть материала перед посевом прогревают при 80° в течение 30 мин., а другую высевают па среды нагретой. Промывные воды и фекалии сеют в количестве 20—25 мл. Мочу и кровь (5—25 мл) высевают на среды без прогревания. Посевы производят на среду Тароцци, пепсин-пептон с 0,5—I % глюкозы и кусочками печени, для выделения типов С, U и Е — на бульон Хотингера с глюкозой и кусочками мяса или печени. Посевы производят в широкие пробирки или (лучше) во флаконы с 200—250 мл среды. Посевы выращиваются под слоем вазелина в обычном термостате при 30—35° в течение 6—10 дней. Для получения токсина Е выращивание производит при 25—28°.  
Для обнаружения токсина первая промывная вода из желудка больного вместе с кусочками пищи, собранная в стеклянную посуду, переносится в стерильную ступку, где кусочки пищи тщательно растирают, затем все собирают в пробирку или колбу и 2 часа экстрагируют при комнатной 1°. Экстракт фильтруют или центрифугируют, прозрачную жидкость используют для постановки реакции на токсин. В крови больного токсин выявляют после центрифугировании для осаждения эритроцитов. Моча для реакции на токсин предварительно не обрабатывается.  
Испражнения в количестве 10—15 г собирают в стерильную ступку или стакан, заливают двойным объемом физиологического раствора и ставят на 1—2 часа в прохладное место для экстрагирования токсина. Затем жидкость фильтруют или центрифугируют и используют для реакции на токсин. При исследовании трупов из каждого органа берется стерильно по 2—3 кусочка но 5—10 г и кровь (10—15 мл). Наиболее часто токсин обнаруживают в печени.  
Бактериологическое исследование продуктов производится для определения их обсемененности бактериями ботулизма и пригодности для производства консервированных продуктов. Образцы свежей, соленой, копченой рыбы, балыков, ветчины, колбасы и других продуктов должны быть весом около 200—250 г. Консервы, главным образом давшие бомбаж, берутся отдельными коробками. Коробки перед посевом моют горячей водой с мылом, обжигают горящим спиртом и стерильно вскрывают, из них засевают продукты и имеющийся соус. Образцы надо брать в местах, вызывающих сомнение в доброкачественности продукта. Из середины каждого образца стерильно вырезают кусочки, размельчают и по 20—25 г засевают в 200—250 мл среды. Для обнаружения ботулинических токсинов в пищевом продукте его берут на исследование в подозрительных местах по органолептическим показаниям в количестве 20—25 г. Если продукт соленый, его растирают в стерильной ступке с двойным объемом дистиллированной воды или физиологического раствора и оставляют при комнатной температуре па 2 часа для экстрагирования токсина, после этого ставят реакцию.  
Выделение микробов ботулизма из почвы представляет значительные трудности. Почва для исследования берется на глубине 5— 10 см в количество 100—150 г в стерильную посуду, закрытую резиновой или притертой пробкой, и хранится в прохладном месте. Для навески почвы одного образца по 20—25 г размельчают в стерильных ступках с двумя объемами физиологического раствора. Суспензию одной навески засевают во флакон или колбу с 200— 250 мл среды, не прогревая. Другую навеску в колбе прогревают на водяной бане при 80° в течение часа. Если хотят убить в почве споры всех слабоустойчивых к температуре бактерий, то суспензию нагревают при 100° в течение 10—20 мин. и после этого засевают на 200—250 мл среды. Из посевов почвы в дальнейшем изучаются только то, культуральная жидкость которых убивает мышь в дозе 0,1—0,25 мл, а морскую свинку — 2,3—3,0 мл.  
Посевы исследуемого материала изучают бактериоскопически через 2—3 суток и при обнаружении подозрительных бактерий ставят с культуральной жидкостью на 2—4 мышах предварительную реакцию нейтрализации с поливалентной ботулинической диагностической сывороткой. Одной или двум мышам вводят подкожно 1.0 мл культуральной жидкости, смешанной с 1,0 мм поливалентной сыворотки, содержащей по 100—500 АЕ антитоксина каждого типа. Окончательное заключение о присутствии токсинов в посевах делается на 6—10 сутки. Выделение чистой культуры производят из посева гретого и нагретого материала. В первых посевах бактерии в чистой культуре могут оказаться нетоксигенными. Необходимы многократные пересевы их на различных средах для подбора наиболее оптимальной среды для токсинообразования. Если в посевах имеется ботулинический токсин, в первых генерациях не следует производить полную очистку штамма от сопутствующих бактерий; это может привести к потере токсигенности. Выделение чистой культуры типов С, U u Е представляет большие "трудности.  
Биологическую пробу и реакцию нейтрализации со специфическими диагностическими сыворотками типов А, В, С, D и Е обычно ставят на мышах и морских спинках. Экстракты из исследуемого материала делят на 2 части. Одну из них кипятят в водяной бане в течение 20—30 мин. для разрушения токсина. Постановка биологической пробы является ориентировочным исследованием и сводится к тому, что каждый образец кипяченой и некипяченой жидкости вводят двум мышам внутривенно по 0,5 или подкожно по 1,0 мл. Двум морским свинкам (весом по 300—350 г) вводят подкожно по 2—5 мл жидкости — одной свинке кипяченую жидкость, а другой — некипяченую. Если в жидкости содержится ботулинический токсин, животные, получившие некипяченую жидкость, погибают, а получившие кипяченую — остаются живыми.  
Заключение о присутствии ботулинического токсина в каком-либо субстрате можно сделать только на основании реакции нейтрализации. Берут 6 Пробирок, в каждую наливают по 1,0 мл исследуемой жидкости, затем в пробирки вносят по 1 мл сыворотки: в первую — типа А, во вторую — В, в третью — С, в четвертую — D, в пятую — Е, в шестую, контрольную пробирку, добавляют 1 мл физиологического раствора. Перед прибавлением сыворотку разводят физиологическим раствором до содержания 100—200 АЕ в 1 мл. После добавления сыворотки пробирки слегка встряхивают, и смесь оставляют на 30— 40 мин. на столе или ставят в термостат при 37° для нейтрализации токсина. Смесь жидкости и сыворотки каждого тина вводят двум мышам внутривенно по 0,5 мл или по 1 мл подкожно. При наличии токсина погибают контрольные мыши, получившие одну жидкость. Остаются живыми лишь те мыши, которые получили жидкость с нейтрализованным токсином, что позволяет определить типовую его принадлежность. Для постановки этой реакции на морских свинках в каждую пробирку вносят по 4 мл жидкости и для нейтрализации токсина по 4 мл сыворотки, животным вводят подкожно по 6 мл этой смеси. Окончательный учет результатов реакции производят на 4—5-й день. Видовая и типовая принадлежность нетоксичных чистых штаммов бактерий ботулизма может быть ориентировочно определена с помощью реакции агглютинации с сывороткой типов А, В, С, D и Е. 

Цель исследования при ботулизме — обнаружение и идентификация токсина; выделение возбудителя — вторичный этап. Лабораторному исследованию при ботулизме подлежат остатки пищевых продуктов, материал, полученный от больного (кровь, испражнения, моча, промывные воды желудка, рвотные массы), и секционный материал. Кровь берут из вены пациента в количестве 5—10 мл; промывные воды из желудка забирают в объёме 50-100 мл, кал — 50-60 г. На секции забирают кусочки печени (50-60 г), отрезки кишечника и желудка и их содержимое. До поступления в лабораторию образцы хранят на холоде.

• Кровь исследуют только на наличие токсина ботулизма (для чего проводят биологическую пробу); испражнения — только на наличие возбудителя (проводят посев на питательные среды), весь остальной материал — на наличие возбудителя и его токсина.

• Банки с консервами при ботулизме выдерживают в термостате 10-12 сут, стерильно отбирают 50-100 г, растирают и центрифугируют. В надосадочной жидкости определяют наличие токсина, в осадке — возбудителя.

• Мясо и рыбу при ботулизме обрабатывают спиртом и забирают пробы из внутренних частей (пробы рыбы рекомендуют брать от хребта и внутренних органов). Пробы изучают аналогично исследованиям консервированных продуктов.

Идентификация токсинов ботулизма

Классический  метод при ботулизме — биологическая проба на мышах. Для опыта отбирают партию из 5 животных. Первое заражают только исследуемым материалом, остальных — исследуемым материалом с введением 2 мл 200 ME антитоксической сыворотки типов А, В, С и Е. При наличии в материале токсина выживает животное, получившее антисыворотку, нейтрализовавшую токсин соответствующего типа. Для идентификации токсинов также используют РПГА с антительным диагностикумом (эритроциты, сенсибилизированные антитоксинами соответствующих типов).

Выделение возбудителя ботулизма

Методы  получения культур возбудителя ботулизма принципиально сходны с таковыми, используемыми для прочих патогенных клостридий.

Серологических  исследований при ботулизме не проводят, так как заболевание не сопровождается выработкой выраженных титров AT, что связано с незначительной (с точки зрения иммуногенных свойств) дозой токсина, вызвавшей поражение.

Ботули́зм (от лат. botulus — колбаса: название связано с тем фактом, что первые описанные случаи заболеваний были обусловлены употреблением кровяных и ливерных колбас) — тяжёлое токсикоинфекционное заболевание, характеризующееся поражением нервной системы, преимущественно продолговатого и спинного мозга, протекающее с преобладанием офтальмоплегического и бульбарного синдромов.

Развивается в  результате попадания в организм пищевых продуктов, воды или аэрозолей, содержащих ботулотоксин, продуцируемый спорообразующей палочкойClostridium botulinum. Ботулотоксин поражает мотонейроны передних рогов спинного мозга, вследствие чего нарушается иннервация мышц, развивается прогрессирующая острая дыхательная недостаточность.

Входными воротами являются слизистые оболочки дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, повреждённая кожа и лёгкие. От человека к человеку инфекцияне передаётся. Несмотря на то, что ботулизм регистрируется гораздо реже, чем другие кишечные инфекции и отравления, он продолжает оставаться актуальным и опасным для жизни заболеванием

Историческая справка

Предполагается, что ботулизмом люди болеют на протяжении всего периода существования  человечества. Так, византийский император Лев VI запретил употребление в пищу кровяной колбасы из-за опасных для жизни последствий^[6]. Однако документально заболевание было зафиксировано только в 1793 году, когда в Вюртемберге заболели 13 человек, употреблявших в пищу кровяную колбасу, 6 из которых умерли. Отсюда болезнь и получила своё название — «ботулизм» (botulus — колбаса).

Позднее, на основании  наблюдений в 1817—1822 годах, Ю. Кернер сделал первое клинико-эпидемиологическое описание заболевания. В изданной им монографии 1822 года он описал симптомы ботулизма (недомогание, рвота, диарея и другие), а также предположил, что небольшие дозы ботулотоксина могут быть полезны в лечении гиперкинезов^[9]. В России эта болезнь неоднократно описывалась в XIX веке под названием «ихтиизм» и связывалась с употреблением солёной и копчёной рыбы, а первое детальное исследование в России сделал Э. Ф. Зенгбуш.

В конце XIX века в Бельгии 34 музыканта, готовившихся играть на похоронах, съели сырую ветчину домашнего приготовления. В течение суток у большинства музыкантов начали проявляться симптомыботулизма. В результате 3 человека погибли, а ещё 10 находились в больнице в течение недели в тяжелом состоянии. Из остатков ветчины и из селезёнки пострадавших бактериолог Эмиль ван Эрменгем выделил возбудитель и назвал его Bacillus botulinus. Также он установил, что токсин образуется не в организме больного, а в толще ветчины. Позже, в 1904 году, русский исследователь С.В. Константинов подтвердил его работы^[6][10][11]. В это же время была создана первая иммунная сыворотка для лечения ботулизма. Исследователь Алан Скотт в 1973 году провёл первые испытания ботулотоксина на животных по снижению активности гиперкинетических мышц, а затем, в 1978 году, под его руководством начались испытания возбудителя на людях, по одобренному протоколуFDA^].

Сейчас, как и  раньше, ботулизм проявляется как  в виде единичных отравлений, так  и в виде групповых случаев. За 1818—1913 гг. в России было зарегистрировано 98 групповых вспышек пищевых отравлений, из-за которых пострадало 608 человек, то есть по 6,2 человека на одну вспышку. За период 1974—1982 гг. произошла 81 вспышка, на которую, в среднем, приходилось по 2,5 заболевших. В последние десятилетия распространены случаи болезни, связанные с употреблением консервов домашнего изготовления.

Классификация

В соответствии с рекомендациями ВОЗ различают четыре категории ботулизма^[5]:

• пищевой ботулизм (заболевание возникает после употребления в пищу продуктов, содержащих накопившийся ботулинический токсин);
• раневой ботулизм (развивается при загрязнении почвой раны, в которой создаются условия, необходимые для прорастания попавших из почвы Clostridium botulinum и последующего токсинообразования);
• ботулизм детского возраста (возникает у детей преимущественно до 6 месяцев, при инфицировании их спорами Clostridium botulinum);
• ботулизм неуточнённой природы (установить какую-либо связь возникшего заболевания с пищевым продуктом не удаётся).

По  степени тяжести различают лёгкую, среднетяжёлую и тяжёлую форму  болезни^[13]. При лёгком течении у больных паралитический синдром ограничивается поражением глазодвигательных мышц; при среднетяжѐлом поражаются и мышцы глотки, гортани. Тяжёлое течение характеризуется дыхательной недостаточностью и тяжёлыми бульбарными нарушениями.

Этиология

Основная  статья: Clostridium botulinum

Возбудитель ботулизма Clostridium botulinum относится к роду Clostridium, семейству Bacillaceae. Это анаэробная, подвижная, грамположительная^[14], спорообразующая палочка размерами (0,6—1,0)х(4—9) мкм.^[15]: В мазках имеет вид палочек с закруглёнными концами, образуют субтерминально расположенные споры, диаметр которых превышает поперечник вегетативной формы. Из-за спор возбудитель имеет форму теннисной ракетки (чем характерно отличается от других клостридий). Не образуют капсулы, подвижны, перитрихи, облигатные анаэробы, располагающиеся беспорядочными скоплениями или небольшими цепочками. Известно 8 типов возбудителя (сероваров) — А, В, С₁, С₂, D, Е, F и G, различающихся по антигенной структуре выделяемого экзотоксина^[13]. Из них патогенны типы A, B, E и, реже, F^[16].

В России преимущественно встречаются типы А, В, Е. Возбудители ботулизма широко распространены в природе и обитают в почве. Бактерия размножается и вырабатывает токсин в процессе жизнедеятельности. Токсины вырабатываются вегетативными формами. Оптимальные условия роста вегетативных форм — крайне низкое остаточное давление кислорода (0,40—1,33 кПа) итемпературный режим в пределах 28—35 °C^[13]. В процессе жизнедеятельности происходит характерное для большинства клостридий газообразование (визуально на консервированных продуктах определяется как 'бомбаж'-вздутие крышки или жестяной банки). Прогревание при температуре 80 °C в течение 30 мин вызывает гибель вегетативных форм, однако его споровые формы способны выживать в течение нескольких часов при температуре 100 °C^[17], и, попадая в благоприятную среду, переходить в вегетативные формы. Для полного уничтожения применяют дробную пастеризацию-тиндализацию^[18]. Ботулотоксин относится к полипептидам и при кипячении в течение свыше 30 мин инактивируется.

Оптимальный рост клостридий и токсинообразование происходят в анаэробных условиях при температуре 35 °C. Вегетативные формы бактерий погибают при 80 °C в течение 30 мин, при кипячении — в течение 5 мин. Токсин устойчив к действию пепсина и трипсина, выдерживает высокие концентрации (до 18 %) поваренной соли, не разрушается в продуктах, содержащих различные специи. Хорошо нейтрализуется в щелочной среде.

Ботулотоксин является одним из наиболее сильных природных ядов (летальная доза для человека 5—50 нг/кг массы тела)^[10][11][19]. Также описаны продуцирующие ботулотоксин штаммы других видов — Clostridium butyricum и Clostridium baratii , но они чрезвычайно редки^[20].

В современной  медицине ботулотоксин является активным составляющим косметического средства Ботокс (известного также под названием Диспорт), использующегося для разглаживания морщин и уменьшения потоотделения. Диспорт с помощью инъекций вводится подкожно в мимические мышцы. Его также применяют для ослабления чрезмерной мышечной активности^[17]. Получить отравление нейротоксином практически невозможно, так как в косметологии используются крайне низкие концентрации яда. Но может случится так, что токсин приведет к смерти. На сегодняшний день Ботокс разрешен для клинического применения в 58 странах мира

Эпидемиология

Механизм  передачи ботулизма — фекально-оральный или контактный (при раневом ботулизме). Пути передачи заболевания могут быть пищевые, воздушно-пылевые (при ботулизме грудных детей) или контактно-бытовые. При этом иммунитет после перенесённого заболевания не развивается. В медицинской литературе описаны повторные случаи заболеваний ботулизмом у одних и тех же людей^[2]. Вспышки ботулизма чаще всего обусловлены токсином типа А, реже — типами В, С, E, F. Токсин D вызывает заболевания только у животных и водоплавающих птиц^[2]. Естественным источником и резервуаром возбудителя является почва, тепло- и холоднокровные животные, поглощающие споры Clostridium botulinum с водой и кормом^[10]. Возбудитель размножается в иле слабопроточных водоёмов, силосных ямах, трупах павших животных. Возбудитель вырабатывает токсин после смерти животных при снижении их температуры тела до 20—25 °C. Отравление токсином возможно только при употреблении продуктов, в которых в анаэробных условиях произошли размножение возбудителя и накопление токсина. Анаэробные условия создаются в результате герметизации продуктов или потребления кислорода аэробной флорой (например, стафилококком). В настоящее время консервы фабричного производства редко являются причиной заболевания. В основном, заражение происходит вследствие употребления грибов, овощей, рыбы и мяса домашнего консервирования.^[11] Однако эпидемии ботулизма могут возникать и из более неожиданных источников, например, в июле 2002 на Аляске у 14 человек были установлены симптомы ботулизма после употребления китового мяса (muktuk, см. en:beached whale), двум из пострадавших потребовался аппарат искусственной вентиляции лёгких^[24]. Существуют и другие источники инфекции, например чеснок или приправы^[25], сохраняемые в растительном масле без подкисления^[26], перец чили, плохо вымытый тушёный в алюминиевой фольге картофель^[27], рыба домашнего консервирования, в частности — ферментированная рыба, таранка и прочее. В России около 50 % случаев болезни связаны с грибами, второе место занимаютмясные изделия^[4]. Но, помимо пищевого ботулизма, регистрируются единичные случаи ботулизма у детей до года, находящихся на искусственном вскармливании питательными смесями, содержащими мёд. Предполагают, что споры заносятся с пылью в нектар, перерабатывающийся пчёлами в мёд, который впоследствии используют в питательных смесях^[4]. Иногда возбудитель размножается в некротизированной ткани и обусловливает возникновение раневого ботулизма