Липазы  широко распространены у млекопитающих (панкреатическая и тканевые липазы), растений, дрожжей и бактерий. Из молока выделена также липаза (липопротеидлипаза), гидролизующая триацилглицерины, связанные с белком, которые входят в состав липопротеинов низкой плотности. [1] 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

1.5 влияние высоких  температур при  технологических  процессах обработки  молока на активность  липазы

 

   Тепловая  обработка молока приводит к потере активности почти всех ферментов, таких как нативная липаза, амилаза, каталаза, фосфатаза. Бактериальная липаза более устойчива. Липаза молока после потери своей активности в результате пастеризации могут вновь ее восстановить, т. е. обладают свойствами реактивации.

   Ферменты, сохранившие свою активность, могут  вызывать в молоке и молочных продуктах нежелательные биохимические процессы, в результате которых снижаются качество, вкусовые свойства и пищевая ценность продуктов. Наибольшую опасность представляют липазы и протеиназы бактериального происхождения: липазы способствуют прогорканию молочных продуктов, вызывают свертывание ультравысокотемпературного молока (в специальных установках молоко нагревают до 120-150 градусов всего за несколько секунд.  При этом погибают все микроорганизмы, а вкусовые и питательные свойства молока не изменяются).

     Нагревание молочного сырья до  температур пастеризации приводит  к инактивации ферментов, тепловая  устойчивость которых также индивидуальна,  как и тепловая устойчивость  микроорганизмов. Температурные режимы пастеризации, принятые в молочной промышленности, инактивируют нативные липазы — при температуре 80 °C, а бактериальные липазы — при температуре 90 °C. Сущность теплового разрушения микроорганизмов и ферментов состоит в тепловой денатурации белковых компонентов клеток, при которой происходит развёртывание их полипептидных цепей с потерей биологических свойств.[3] 
 
 
 
 
 

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ  ЧАСТЬ

2.1 МАТЕРИАЛЫ  ИССЛЕДОВАНИЯ 

     Для проведения эксперимента были взяты  два образца:

     1)контроль  – домашнее молоко от зааненской козы, возраста 4года;

     2) опыт – кипяченое домашнее молоко этой же козы.

2.2 методика исследования

 

   Определение активности липазы методом титрования раствором щелочи.

   Цель: определить влияние температуры 85-90°С в течении 30 секунд на активность липазы коровьего молока.

   Оборудование: колбы конические на 100 мл (18 шт.); пипетки  для прямого слива с одной  меткой на 1 и 10 мл; бюретка на 15-20 мл; воронка стеклянная для фильтрования; цилиндр мерный на 50 мл; ступка с пестиком; термостат на 37°С; марля.

   Материалы и реактивы: свежее и стерилизованное  коровье молоко; желчь; фенолфталеин, 1%-ный раствор; гидроксид натрия, 0,1н. раствор; липаза лиофилизированная, мезим или фестал.

   Получение препарата липазы: при отсутствии в продаже лиофилизированного препарата фермента липазу можно получить из мезима или фестала. Берем таблетку мезима, очищаем ее от оболочки, тщательно растираем в ступке с тройным количеством воды. Полученную смесь использовать как ферментный препарат.

    Ход анализа:

1. В три конические колбы на 100 мл налить по 50 мл молока, в колбы № 1 и № 2 (опыт) добавить по 2 мл препарата липазы или по 1 мл раствора лиофилизированной липазы (мезима или  фестала), содержащего 1 мг препарата в 1 мл, в колбу №3 (контроль) – столько же предварительно прокипяченного препарата фермента. В колбу №1 добавить 5-6 капель желчи (для активирования липазы).
2. Содержимое колб быстро перемешать, сейчас же отобрать пипеткой по 10 мл жидкости и перенести их в три другие колбы на 100 мл (для титрования).
3. Первые три колбы (№1, 2 и 3) поставить в термостат или в водяную баню при 37-40°С на 90 минут.
4. В колбы для титрования (№4, 5 и 6) добавить по 10 мл воды и по 2-3 капли раствора фенолфталеина. Оттитровать содержимое каждой колбы 0,1н. раствором гидроксида натрия до слабо-розового окрашивания при непрерывном и тщательном помешивании.
5. Результаты титрования записать в таблицу.
6. Через 15, 30, 60 и 90 минут (еще четыре раза) после начала инкубации, отобрать из колб № 1, 2 и 3 по 10 мл, поместить в сухие колбы и во все добавить по 10 мл воды и по 2-3 капли раствора фенолфталеина. Оттитровать содержимое каждой колбы 0,1н. раствором гидроксида натрия до слабо-розового окрашивания при непрерывном и тщательном помешивании. Данные занести в таблицу.
7. Активность липазы вычисляют по формуле:

X=(b*k*5.6)/m

где X – кислотное число жира или масла в мг на 1г

b – количество 0,1н. раствора гидроксида натрия, израсходоного на титрование взятой навески из жира или масла, в мл

k – поправка на титр щелочи, k=1

m – масса навески жира, г 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

2.3 результаты исследования 

Таблица 13 – Количество 0,1 н раствора NaOH, пошедшего на титрование жирных кислот в молоке зааненской козы, жирностью 4,5%, мл. 

 
 

100г  – 4,5%  

10г –  Х%

Х = (10 * 4,5)/100 = 0,45 

               0 минут:                           15 минут:                            30 минут:

X₁ = (3,8*5,6)/0,45 = 42,29 мг%  X₁ = (4,7*5,6)/0,45 = 58,49 мг%  X₁ = (8,0*5,6)/0,45 = 99,56 мг%

X₂ = (4,3*5,6)/0,45 = 53,51 мг% X₂ = (5,6*5,6)/0,45 = 69,69 мг%  X₂ = (8,9*5,6)/0,45 = 110,76 мг%

X₃ = (4,4*5,6)/0,45 = 54,76 мг%  X₃ = (3,7*5,6)/0,45 = 46,04 мг%  X₃ = (3,6*5,6)/0,45 = 44,80 мг%

X₄ = (3,2*5,6)/0,45 = 39,82 мг%  X₄ = (3,3*5,6)/0,45 = 41,07 мг% X₄ = (3,3*5,6)/0,45 = 41,07 мг%

X₅ = (3,2*5,6)/0,45 = 39,82 мг%  X₅ = (3,3*5,6)/0,45 = 41,07 мг%  X₅ = (3,3*5,6)/0,45 = 41,07 мг%

                   

                               60 минут:                                    90 минут:

           X₁ = (10,2*5,6)/0,45 = 126,93 мг%         X₁ = (12,2*5,6)/0,45=151,82 мг%          

           X₂ = (10,4*5,6)/0,45 = 129,43 мг%          X₂ = (12,4*5,6)/0,45=154,31 мг%          

           X₃ = (8,3*5,6)/0,45 = 41,07 мг%              X₃ = (3,5*5,6)/0,45=43,56 мг%                

           X₄ = (3,3*5,6)/0,45 = 41,07 мг%             X₄ = (3,2*5,6)/0,45=39,82 мг%        

           X₅ = (3,3*5,6)/0,45 = 41,07 мг%             X₅ = (3,3*5,6)/0,45=41,07 мг%                  
 
 
 

Таблица 14 - Влияние желчи и препарата липазы на содержание жирных кислот в сыром и кипяченом козьем молоке, жирностью 4,5% мг%

 

Из Таблицы 14 видно, что:

     В начальной точке содержание жирных кислот в кипяченом молоке с введением лиофилизированной липазы и желчи  возросло в 1,27 раза по сравнению с молоком с добавлением лиофилизированной липазы.

     Через 15 минут термостатирования, количество жирных кислот в молоке с лиофилизированной липазой и желчью возросло в 1,19 раза по сравнению с молоком с добавлением лиофилизированной липазы.

     Через 30 минут термостатирования, количество жирных кислот в молоке с лиофилизированной липазой и желчью возросло в 1,11 раза по сравнению с молоком с добавлением лиофилизированной липазы.

     Через 60 минут термостатирования, количество жирных кислот в молоке с лиофилизированной  липазой и желчью возросло в 1,02 раза по сравнению с молоком с добавлением лиофилизированной липазы.

     Через 90 минут термостатирования, количество жирных кислот в молоке с лиофилизированной липазой и желчью возросло в 1,016 раза по сравнению с молоком с добавлением лиофилизированной липазы. 

     За 90 минут термостатирования, активность лиофилированной липазы с желчью возросло на 3,59 раза, а активность лиофилизированной липазы – в 2,88 раза.

Выводы

 

   По  поставленной цели и поставленным задачам  курсовой работы можно сделать выводы:

1. Коровье молоко обладает высокой биохимической ценностью: содержит незаменимые аминокислоты, полиненасыщенные  жирные кислоты (линолевую,  линоленовую и арахидоновую), углеводы (лактозу), ферменты, витамины (холин, витамин С, витамин D), макроэлементы (калий, кальций, фосфор) и микроэлементы (железо, медь, селен, йод, марганец, цинк), обуславливающие ее.
2. Липазы представляют собой группу ферментов, гидролизующих сложные эфиры глицерина и жирных кислот. Расщеплению подвергаются только эфирные связи, образованные углеродными атомами в 1-м и 3-м положении (α-положении). При гидролизе молекулы субстрата образуются две молекулы жирных кислот и молекула 2-ацилглицерина (β-моноглицерид). Его гидролиз протекает медленно, он способен превращаться в α-форму (3-ацилглицерин), что приводит к отщеплению остатка третьей жирной кислоты от глицерина.
3. Липаза состоит из одной полипептидной цепи с 6 дисульфидными связями и содержит 2 меркаптогруппы, блокирование которых не влияет на активность фермента, активный центр содержит серин.
4. Тепловая обработка молока приводит к потере активности липазы, инактивация которой при пастеризации позволяет снизить ее активность, вызывающую в молоке и молочных продуктах нежелательные биохимические процессы, в результате которых снижаются качество, вкусовые свойства и пищевая ценность продукта.
5. При добавлении к лиофилизированной липазе желчи активность ее выросла в 1,27  раза, по сравнению с лиофилизированной липазой, что говорит о том, что желчь является активатором лиофилизированной липазы. С увеличением времени термостатирования, активность липазы увеличивается.