История вирусологии. Принципы классификации вирусов

Для культивирования  вирусов в лабораторных условиях используются ледуюшие живые объекты: 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные мбрионы; 3) лабораторные животные.

I. Культуры клеток

Наибольшее распространение   имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на 1) первичные (первично трипсинизированные), 2) полуперевиваемые (диплоидные) и 3) перевиваемые.

По происхождению они классифицируются на эмбрионштьные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу - на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток - это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (или диплоидные) культуры клеток - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом.

Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные  культуры (например, СОЦ, ПЭС, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских  хомяков; ПМС - из почки морской свинки и др.) отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными.

Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Нер-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH - из почки человека.

Для культивирования  клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся  на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят  стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред - сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

 

Выделение вирусов в культурах клеток и  методы их индикации.

При выделении вирусов  из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые  отделяемые, смывы из органов) применяют  культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

Индикатором наличия  вируса в заражённых культурах клеток может служить:

1) развитие специфической  дегенерации клеток - цитопатическое  действие вируса (ЦПД), которое имеет три основных типа: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток - симпластов; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток ;

2) обнаружение внутриклеточных  включений, располагающихся в  цитоплазме и ядрах пораженных  клеток;

3) положительная реакция  гамагтлютинации (РГА);

4) положительная реакция  гемадсорбции (РГАдс);

5) феномен бляшкообразования:  монослой зараженных вирусом  клеток покрывается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного (фон - розовый). При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара.

6) при отсутствии ЦПД  или ГА можно поставить реакцию  интерференции : исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

II. Выделение  вирусов в куриных эмбрионах.

Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста.

Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоско-пировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка. Заражают куриные эмбрионы в асептических условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом.

Методы заражения куриных  эмбрионов могут быть различны: нанесение  вируса на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный мешок. Выбор  метода заражения зависит от биологических свойств изучаемого вируса.

Индикация вируса в курином  эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по фокусным поражениям («бляшкам») на хорион-аллантоисной оболочке.

III. Выделение  вирусов на лабораторных животных.

Лабораторные животные могут быть использованы для выделения  вирусов из инфекционного материала, когда невозможно применить более удобные системы (культуры клеток или куриные эмбрионы). Берут преимущественно новорождённых белых мышей, хомяков, морских свинок, крысят. Заражают животных по принципу цитотропизма вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные - интрацеребрально, дерматотропные - на кожу.

Индикация вируса основана на появлении признаков заболевания у животных, их гибели, патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, а также по положительной реакции гемагглтотинации с экстрактами из органов.

Вирусные заболевания, их особенности

 

Вирусы, в отличие от других микроорганизмов, вызывают 2 группы заболеваний:

1) вирусные инфекции,

2) опухоли (доброкачественные  и злокачественные). Особенности  вирусных инфекций:

1. Вирусные инфекции - широко распространённые. Их удельный  вес в структуре инфекционной заболеваемости может составить 60-80%.

2. Внутриклеточное размножение  вирусов приводит к массовой  гибели клеток организма.

3. Размножение некоторых  вирусов (ВИЧ, вирусы кори, гепатита  В, С) в клетках иммунной системы приводит к развитию иммунодефицитного состояния.

4. Способность некоторых  вирусов интегрироваться с геномом  клетки (ВИЧ, вирус гепатита В,  онкогенные РНК-содержащие вирусы).

5. Некоторые вирусы (краснухи, цитомегалии) обладают тератогенным  действием.

6. Инфекционные вирусы  могут провоцировать развитие опухолей (аденовирусы, герпесвирусы, вирусы гепатитов В, С, G).

7. Вирусы могут вызывать  медленные инфекции (ВИЧ, вирусы  кори, бешенства, гепатита В, герпеса и др.).

8. Иммунопрофилактика  многих вирусных инфекций отсутствует.

9. Диагностика вирусных заболеваний применяется не в каждом конкретном случае из-за массовости этих заболеваний.

10.До настоящего времени недостаточно  эффективных средств для лечения  вирусных заболеваний.

 

КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Уровень клетки

 

 

 

Уровень организма

 

 

 

 

 

 

 

 

 

На клеточном уровне выделяют автономные инфекции, если вирусный геном реплицируется независимо от клеточного, и интеграционные инфекции, если вирусный геном включается в  состав клеточного. Автономная инфекция делится на продуктивную, при которой образуется инфекшюнное потомство, и абортивную, при которой инфекционный процесс обрывается, и новые вирус ные частицы или не образуются совсем, или образуются в небольшом количестве. Продуктивная и абортивная инфекции могут быть острыми и хроническими. Острая инфекция в зависимости от судьбы заражённой клетки делится на цитолитическую и нецитолитическую. Цитолитическая инфекция завершается деструкцией клеток, или ЦПД, а вирус, вызывающий ЦПД, называется цитопатогенным.

На уровне организма вирусные инфекции делятся на 2 группы: 1) очаговые, когда размножение и действие вируса проявляется у входных ворот; 2) генерапизованные, при которых вирус после размножения во входных воротах разносится по различным органам и тканям, формирует вторичные очаги инфекции. Примерами очаговой инфекции являются ОРВИ и ОКИ, генерализованной - полиомиелит, корь, оспа.

Острая инфекция протекает  непродолжительно, сопровождается выделением вируса в окружающую среду, заканчивается либо выздоровлением, либо гибелью организма. Острая инфекция может проявляться рядом симптомов (манифестная инфекция), а может быть бессимптомной (инаппарантная инфекция).

При длительном взаимодействии вируса с макроорганизмом возникает  персистентная инфекция (ПИ). В зависимости от состояния организма один и тот же вирус может вызвать как острую инфекцию, так и персистентную (вирусы кори, герпеса, гепатитов В, С, аденовирусы). Клинические проявления при ПИ могут быть выраженными, слабо выраженными, или отсутствовать совсем, вирус может выделяться в окружающую среду или нет. По этим признакам ПИ делят на латентные (скрытые инфекции, без выделения вируса, вызываются он-когенными вирусами, ВИЧ, вирусами герпеса и адено-); хронические (характеризующиеся периодами ремиссий и обострений, когда вирус выделяется в окружающую среду. Примерами хронической инфекции являются герпетическая, аденовирусная, хроническая форма гепатитов В и С и др.); медленные (характеризуются длительным инкубационным периодом, медленным развитием симптомов, ведущих к тяжёлому нарушению функций организма и летальному исходу).

Этиология медленных инфекций

Медленные инфекции, поражающие человека и животных, по этиологии  можно разделить на 2 группы:

I группа - это медленные инфекции, вызываемые прионами. Прионы - это белковые инфекционные частицы (protein infections particle), имеют форму фибрилл, длиной от 50 до 500 нм, массой 30 кД. Не содержат нуклеиновой кислоты, устойчивые к действию протеаз, нагреванию, к действию ультрафиолета, ультразвука и ионизирующей радиации. Прионы способны к репродукции и накоплению в составе поражённого органа до гигантских величин, не вызывают ЦПД, иммунного ответа и воспалительных реакций. Повреждение ткани по дегенеративному типу.

Прионы у человека вызывают заболевания:

1) Куру («хохочущая смерть») - медленная инфекция, эндемичная  для Новой Гвинеи. Характеризуется  атаксией и тремором с постепенным  полным поражением двигательной активности, дизартрией и смертью через год после появления клинических симптомов.

2) Болезнь Крейтцфельдта-Якоба,  характеризуется прогрессирующей  деменци-ей (слабоумием) и симптомами  поражения пирамидных и экстрапирамидных  путей.

3) Амиотрофический лейкоспонгиоз,  характеризуется дегенеративным  разрушением нервных клеток, в результате чего мозг приобретает губчатую (спон-гиоформную) структуру.

Прионовые заболевания  у животных:

1) Бычья спонгиоформная  энцефалопатия (бешенство коров);

2) Скрепи - подострая трансмиссивная  губкообразная энцефалопатия овен.

II группа - это медленные инфекции, вызываемые классическими вирусами.

К медленным вирусным инфекциям человека относятся: ВИЧ-инфеюшя -СПИД (вызывает ВИЧ, сем. Retrovoridae); ПСПЭ - подострый склерозируюший панэнцефалит (вирус кори, сем. Paramyxoviridae); прогрессирующая врождённая краснуха (вирус краснухи, сем. Togaviridae); хронический гепатит В (вирус гепатита В, сем. Hepadnaviridae); цитомегаловирусное поражение мозга (вирус цитомегалии, сем. Herpesviridae); Т-клеточная лимфома (HTLV-I, HTLV-II, сем. Retroviridae); подострый герпетический энцефалит (herpes simples, сем. Herpesviridae) и др.

Кроме медленных инфекций, вызываемых вирусами и прионами, существует группа нозологических форм, которые по клинике и исходу соответствуют признакам медленной инфекции, но точных данных об этиологии ешё не имеется. К таким заболеваниям относятся рассеянный склероз, амиотрофический боковой склероз, атеросклероз, шизофрения и др.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций

В основе лабораторной диагностики  вирусных инфекций лежат 3 группы методов:

1 группа - Обнаружение возбудителя или его компонентов непосредственно в клиническом материале, взятом от больного, и получение ответа через несколько часов (быстрая; экспресс-диагностика). Методы экспресс-диагностики наиболее распространённых вирусных инфекций приведены в табл. 2.