Биообъекты растительного происхождения в биотехнологии

Размеры водорослей  колеблются от долей микрона (кокколитофориды  и некоторые диатомовые) до 40 м (макроцистис). Многие одноклеточные; среди них есть подвижные, совершающие скользящие движения (диатомовые, десмидиевые, синезелёные), механизм передвижения которых окончательно не выяснен, и В., снабженные жгутиками, во многом подобные простейшим — жгутиковым, но отличающиеся от них наличием хлорофилла и хроматофоров. Они могут утрачивать хлорофилл (в темноте), становиться бесцветными и существовать за счёт поглощения органических веществ, растворённых в воде; есть также виды одноклеточных водорослей способные, подобно простейшим, захватывать органические частицы (некоторые пиррофитовые). Одноклеточные Водоросли часто при помощи слизи или выростов объединяются в колонии. Среди многоклеточных В. наряду с крупными есть микроскопические; наиболее просто организованные из них имеют вид разветвленных нитей, состоящих из одного ряда клеток; другие имеют слоевища: корковидные, шнуровидные, шаровидные, пластинчатые или кустистые с "листьями", снабженными жилками (саргассум). У части синезелёных, зелёных и красных В. в слоевище откладываются соединения кальция, и оно становится твёрдым. В. лишены корней и поглощают нужные им вещества из воды всей поверхностью. Крупные донные В. имеют органы прикрепления — подошву (уплощённое расширение в основании) или ризоиды (разветвленные выросты). У некоторых В. побеги стелются по дну и дают новые слоевища.

Размножение водорослей. — вегетативное, бесполое и половое. Многие одноклеточные размножаются делением на две части. Крупные водоросли  размножаются вегетативно — частями слоевища или при помощи специальных почек (сфацеляриевые). Некоторые многоклеточные водоросли не имеют полового размножения, у большинства же образуются споры и гаметы либо в обычных клетках, либо в особых образованиях — спорангиях и гаметангиях ; споры и гаметы бывают неподвижными (красные, конъюгаты) или подвижными — со жгутиками. У водорослей. наблюдаются все формы полового процесса: изогамия, гетерогамия, оогамия и конъюгация (слияние протопластов двух вегетативных клеток). Образующаяся в результате полового процесса зигота делится сразу или после периода покоя. Одновременно в ней может происходить мейоз. У примитивных В. одна и та же особь даёт гаметы или споры в зависимости от внешних условий. У других водорослей. функции бесполого и полового размножения выполняют разные особи (спорофиты и гаметофиты); они могут произрастать одновременно в одинаковых условиях (фурцелярия); одновременно, но в разных местообитаниях (бангиевые); в одних и тех же местообитаниях, но в разные сезоны. У ряда В. происходит строгое чередование гаметофита и спорофита, которое принято называть "чередованием поколений". При этом у высших В. зигота или прорастает на гаметофите, на нём же вырастает и спорофит (ламинариевые), а гаметофит отмирает, или спора, не отделяясь от спорофита, прорастает в гаметофит, который развивается на спорофите (фукусовые). Советские специалист по водорослям. — альголог М. М. Голлербах предложил для этого явления термин "смена форм развития", наиболее верно отражающий существо процесса. Спорофит у В. часто диплоиден (ядра содержат двойной набор хромосом), а гаметофит гаплоиден (ядра с одинарным набором хромосом). В ряде случаев гаметофит и спорофит находятся в одной ядерной фазе — оба гаплоидны (бангиевые) или оба диплоидны (некоторые кладофоры, фукусовые).

Мелкие свободноплавающие  водоросли. входят в состав планктона и, развиваясь в больших количествах, вызывают "цветение" (окрашивание) воды. Бентосные В. прикрепляются ко дну водоёма или к другим В. Есть В., внедряющиеся в раковины и известняк (сверлящие); встречаются (среди красных) и паразитические. 
 
 

2.2 Клетки высших растений 

       Клетки высших растений. Высшие растения (порядка 300 ООО видов) — это дифференцированные многоклеточные, преимущественно наземные организмы. Способы их бесполого и полового размножения хорошо описаны в учебниках ботаники. В процессе дифференциации и специализации клетки растений группировались в ткани (простые — из однотипных клеток, и сложные — из разных типов клеток). Ткани, в зависимости от функции, подразделяют на образовательные, или меристемные (от греч. meristos—делимый), покровные, проводящие, механические, основные, секреторные (выделительные). Из всех тканей лишь меристематические способны к делению и за их счет образуются все другие ткани. Это важно для получения клеток, которые затем должны быть включены в биотехнологический процесс (см. специальную часть),

     Клетки  меристемы, задерживающиеся на эмбриональной стадии развития в течение всей жизни растения, называются инициальными, другие постепенно дифференцируются и превращаются в клетки различных постоянных тканей — конечные клетки.

В зависимости  от топологии в растении меристемы подразделяют на верхушечные, или апикальные (от лат. арех — верхушка), боковые, или латеральные (от лат. lateralis — боковой) и промежуточные, или интеркалярные

     В 1902 г. Г. Хаберландт впервые сделал попытки культивировать клетки растений.

     Здесь следует отметить, что Г. Хаберландт впервые выдвинул гипотезу о тотипотент- н о с т и любой живой клетки растения. Тотипотентность — это свойство соматических клеток растений полностью реализовать свой потенциал развития вплоть до образования целого растения.

Любой вид растения может дать в соответствующих  условиях неорганизованную массу делящихся  клеток — каллус (от лат. callus

мозоль), особенно при индуцирующем влиянии растительных гормонов. Массовое производство каллусов с дальнейшей регенерацией побегов пригодно для крупномасштабного производства растений. Вообще каллус представляет собой основной тип культивируемой на питательной среде растительной клетки. Каллусная ткань из любого растения может длительно рекультивироваться. При этом первоначальные растения (в том числе и меристемати- ческие), дедифференцируются и деспециализируются, но индуцируются к делению, формируя первичный каллус.

Кроме выращивания  каллусов удается культивировать клетки некоторых растений в суспензионных культурах.

     Важными биообъектами представляются также  и протопласты растительных клеток. Методы их получения принципиально  сходны с методами получения бактериальных и грибных протопластов. Последующие клеточно-инженерные эксперименты с ними заманчивы по возможным ценным результатам. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

3.Культивирование  клеток растений  в глубинных условиях

       В случае выращивания клеток растений в глубинных (погруженных) условиях необходимо иметь такие их линии, которые отвечали бы следующим требованиям: склонность к размножению в дезагрегированном состоянии, морфологическая "выравненное т ь", удовлетворительная скорость раз- м н о ж е н и я, сохранность путей метаболиз-

м а. (рис. 143). Использование тка- ни-"няньки" (суспензионная культура) при выращивании колоний из одиночных клеток кукурузы или протопластов (схема): 1 — качалоч- ная колба, 2 — колония, возникшая из отдельной клетки, 3 — фильтровальная бумага, 4 — металлическая сетка, 5 — суспензия клеток "кормящего слоя", 6 — подложка (пенополиуретан), 7 — питательная среда   Такие клеточные линии уподобляются одноклеточным микроорганизмам и могут называться "суспензионными культурами" в случае их выращивания в жидких питательных средах. Состав и реологические характеристики сред являются основными факторами, определяющими нахождение одиночных или аггломериру- ющихся (агрегирующихся) клеток во взвешенном состоянии. Если число клеток в аггломератах превышает 50, то они могут выпасть (или выпадают) в осадок. Желательно, чтобы в процессе размножения клетки дольше оставались в разобщенном состоянии, тогда по/удержание суспензионной культуры в течение необходимого времени оказывается вполне достижимым.

     Что касается морфологической "выравненности" клеток, то при этом имеют в виду их округлую (или сферическую) форму, уплотненную цитоплазму, сравнительно небольшие размеры (в среднем, от 10 до 50 мкм) и отсутствие трахеидоподобных элементов. Одиночные растительные клетки в таких случаях напоминают одноклеточные эукариотические микроорганизмы; их ростовые характеристики (фазы размножения) в некотором приближении также оказываются совпадающими (1ад-фаза, log-фаза, const-фаза, let-фаза), хотя временные интервалы между фазами более растянуты для клеток растений.

Скорость размножения растительных клеток невелика—время удвоений их числа равно 1—3 суткам и поэтому по данному показателю они существенно уступают, например, бактериальным и дрожжевым клеткам, время удвоения которых в глубинных условиях укладывается для большинства видов в 20—30 минут. Однако, переводя культуру растительных клеток на хемостатное (непрерывное) выращивание, можно добиться их высокой продуктивности по биомассе или по вторичным метаболитам (пример с Nicotiana tabacum).

     Исходные  клеточные суспензии обычно получают из рыхлых, оводненных каллусных тканей (2—3 г на 60—100 мл питательной среды), подвергнутых обработке пектиназой и полигалактурона- зой, и помещаемых в жидкую питательную среду, лишенную ионов кальция, но содержащую ауксин — 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту. Условия выращивания поддерживают либо в периодическом, либо в непрерывном режиме, специально подобранном для конкретного биообъекта. В других случаях источниками суспензионных культур могут быть протопласты с реконструированными клеточными стенками. Стимулировать деления отдельных клеток изолированных протопластов можно с помощью обогащенных

питательных сред или использованием гомологичной ткани  — "няньки" ("кормящий слой"), находящейся в состоянии активного  роста (рис. 143). Колонии из отдельных клеток (клоны) могут быть субкультивированы один или более раз (при необходимости), а затем переведены в суспензионные культуры.

     Важно также сохранить присущие клеткам метаболические пути при их выращивании в суспензионных культурах. Более того, регулируя обмен, можно добиваться заметного повышения выхода целевых продуктов. При этом всегда необходимо учитывать тип дифференцировки, или состояния специализации исходных клеток, так как от него зависит видоспецифичность первичного и вторичного метаболизма.

     Суспензионные культуры обычно выращивают в подходящих емкостях роллерного типа после фильтрации первичной суспензии через стерильные металлические, нейлоновые илигмарлевые сита для освобождения от крупных  аггломератов клеток.

К сожалению, выращивание растительных клеток в "погруженных" условиях пока удается в редких случаях, что обусловлено недостаточной глубиной познания всех особенностей обмена веществ у различных видов и их клеточных культур; определенные помехи здесь связаны и с медленным ростом клеток в строго асептических условиях, их чувствительностью к механическим повреждениям и другими причинами.

     В начале 80-х годов в компании Mitsui-Petrocherpica] Industries осуществлен первый крупномасштабный процесс по выращиванию воробейника (Lithospermum erythrorhizon) в погруженных условиях в целях получения вторичного метаболита — шиконина

являющегося ценным фармацевтическим препаратом и красителем . За один периодический процесс удается получать порядка 5 кг конечного продукта, накапливающегося в клетках. На первой стадии клетки воробейника выращивают на среде (с подачей стерильного воздуха) в 200-литровом биореакторе в течение 9 суток; затем культуру переносят в биореактор меньшего размера со средой (М-9), стимулирующей продукцию шиконина, и, наконец, в третьем реакторе на 750 л ферментацию ведут в течение 2 недель. Клетки на первой стадии белые, на последней — красные (накоплен шиконин). Стоимость красителя в 1983 г. составляла 4000 долларов за килограмм. 
 
 
 
 
 
 
 
 

4. Аппаратурное оснащение производств, использующих в качестве биообъектов растительные клетки 

       Особенностями растительных клеток. являются: их склонность к объединению в тканевые структуры, которые ,в целостном организме "омываются" жидкостями определенного состава, содержащими.многие регуляторные вещества, оказывающие заметное влияние на функцию тканей; малые скорости роста и развития растительных клеток, а некоторые из них вообще не культивируются в глубинных условиях на жидких питательных средах; хемогетеротрофизм (а не фотоавтотрофизм) растущих

клеток в культуре; синтез целевого продукта лишь агломератами

клеток в одних  случаях (не отдельными клетками) —  здесь сказывается позитивная роль дифференциации в клеточных агломератах

зависимости от вида и потребностей клеток их  мембранный контейнер

     для выращивания растительных

     культур (рис.112)           культивируют в разных биореакторах (с механическим перемешиванием,. колонного типа).   Фирма «Sigma» (США) выпускает мембранные наборы (Rafts) для растительных культур тканей, что помогает исключить ингибиторы, нередко присутствующие в агар-агаре и других желирующих агентах.

     Мембранные  наборы (Rafts) предназначены для выращивания протопластированных и других культур, которые могут поддерживаться длительное время без смены культурального контейнера.     Мембранные наборы (Rafts) имеют квадратную (60х60 мм и д.р) или круглую (73 мм в диаметре и д.р) форму. Их изготавливают из полипропилена с размером пор, в среднем, 0,075х0,25мкм ( площадь всех пор занимает порядка 45% мембраны толщиной 25мкм; они пригодны для потока воды 288 л/м²/час Мембраны устойчивы к действию сильных кислот, оснований и к органическим растворителям (за исключением галогенизиро- ванных углеводородов).