2)Типы препаратов для
микроскопии. Основные принципы
приготовления
Процесс
приготовления препарата по Граму:1) на фиксированный
мазок поместить фильтровальную бумажку,
пропитанную генцианвиолетовым и смочить
дистил. водой;2)Снять бумагу и не промывая
налить на мазок раствор Люголя на 1 мин.
До полного почернения мазка;3)Раствор
сливают, мазок прополаскивают этиловым
спиртом и дистил водой;5)для выявления
грамм- группы препарат дополнительно
окрашивают фуксином или сафранином (2-5
мин);6)Промывают водой, микроскопируют
с иммерсией.Раздавленная капля Применяется при исследовании
бактерий, клеток культуры тканей, простейших,
ряда водорослей и других мелких организмов. на поверхность чистого сухого
предметного стекла наносят каплю воды,
в каплю вносят небольшое количество исследуемой
культуры . Приготовленную каплю накрывают
покровным стеклом, избегая образования
пузырьков воздухаВисячая капля — метод
микроскопирования живых бактерий при физиологических условиях роста;
позволяет многодневно наблюдать объект.
Для приготовления висячей капли берут
пинцетом покровное стекло, проводят через
пламя и остужают. В центр стекла наносят
каплю исследуемого материала,Затем покровное
стекло быстро поворачивают каплей вниз
и кладут на стерильное предметное стекло
с вышлифованной посредине лункойФиксация - обработка образца,
предназначенного для микроскопирования,
с целью сохранить, их структуры в неизменном
состоянии. При фиксировании мазок закрепляется
на поверхности предметного стекла, и
поэтому при последующей окраски препарата
микробные клетки не смываются. Кроме
того, убитые микробные клетки окрашиваются
лучше, чем живые. Физический
способ : предметное стекло с препаратом берут
пинцетом или пальцами правой руки за
ребра мазком кверху и плавным движением
проводят 2-3 раза над верхней частью пламени
горелки. Весь процесс фиксации должен
занимать не более 2 сек. Химический
способ: для фиксации мазков применяют метиловый
спирт, ацетон, смесь Никифорова, жидкость
Крауна. Предметное стекло с высушенным
мазком погружают в склянку с фиксирующим
веществом на 10-15 мин и затем высушивают
на воздухе.
3) Lactobacillus bulgaricus. Характеристика.
Применение.
Используется при производстве йогурта,
основа Мечниковской простокваши. Спор
не обр, неподвижны, палочка 20 микрон, иногда
в коротких цепочках. Относится к термофилам
Топт=400, гомоферментативна.
Молоко свертывает быстро, содержание
молочной кислоты достигает 32 г/л, после
чего гибнут.
Билет 10
Вопрос 1. Пищевые потребности
микроорганизмов. Факторы роста.
Пищевым называют вещество, которое может
служить источником энергии или пластическим
материалом. Бактерии не способны захватывать
твердые частицы и поэтому используют
питательные вещества в виде простых
молекул из водных растворов. В зависимости
от способности усваивать разные формы
углеродосодержащих соединений все микроорганизмы
делятся на автотрофы и гетеротрофы. При
характеристике питания микроорганизмов
учитывается источник углерода, энергии
и водорода. Факторы роста - биологически
активные вещества, в отсутствии которых
многие микроорганизмы не растут даже
на питательных средах, содержащих необходимые
источники энергии, углерода и азота. В
общем виде питательную среду можно представить
как:
источники углерода: для гетеротрофных
бактерий источниками углерода чаще всего
являются углеводы; бактерии могут потреблять
как широкий спектр, так и узкий ряд сахаров.
Источники азота: молекулярный азот,
мочевая кислота, соли аммония, нитриты
и нитраты.
Источники фосфора: неорганические фосфаты.
Источники серы: сульфаты и сульфиды,
молекулярная сера.
Факторы роста (аминокислоты, витамины,
пуриновые и пиримидиновые основания,
стерины)
Вопрос 2. Правила работы с
микроскопом. Воздушное микрокопирование.
Возможности, ограничения метода.
Для освещения микроскопа следует использовать
искусственное освещение. Вращая рукой
револьвер поставить на оптическую ось
самое маленькое увеличение, подвести
объектив под тубус. Щелчок говорит о том,
что объектив закреплен на оптической
оси. Смотрю в окуляр уловить зеркалом
лучшую освещенность поля зрения. Установить
препарат на фокус. Поставить на столик
микроскопа препарат и зажать его клеммами.
Наблюдая сбоку, опустить объектив с помощью
макрометрического винта почти до препарата.
Смотря в микроскоп, медленно поднимать
тубус до появления отчетливых контуров.
Уточнить фокус вращением микрометрического
винта не более чем на один-два полных
оборота в одну и другую стороны.
Вопрос 3. Oenococcus oeni. Характеристика.
Систематическое положение. Применение.
Грам+; гетероферментный кокк; принимает
участие в созревании вин, т к сбраживает
яблочную и лимонную кислоты с образованием
диацетила и ароматических веществ. В
результате кислотность вина падает, а
само вино приобретает характерный букет
и аромат. Углеводы которые способствуют
сбраживанию: сахароза, глюкоза, фруктоза,
пируват. Синтезирует ферменты которые
остаются активными в присутствии сернистого
газа и этанола. Предел содержания спирта
10%. Кроме молочно-кислого осуществляют
яблочнокислое брожение и в основном работает
после спиртового брожения вина.
Билет 11
Вопрос 1. Типы питания автотрофы,
гетеротрофы, хемотрофы, фототрофы, литотрофы,
органотрофы. Сапрофиты и паразиты.
Автотрофы − организмы, получающие все нужные
им для жизни химические элементы из окружающей
косной материи и не нуждающиеся в готовых
органических соединениях другого организма
для построения собственного тела. Основной
источник энергии, используемый автотрофами,
− Солнце. Среди автотрофов выделяют фототрофы (используют
в качестве источника энергии солнечный
свет) и хемотрофы (используют
энергию, выделяющуюся при окислении неорганических
веществ). Гетеротро́фы - организмы,
которые не способны синтезировать органические
вещества из неорганических путём фотосинтеза или хемосинтеза.
Для синтеза необходимых для своей жизнедеятельности
органических веществ им требуются экзогенные
органические вещества, то есть произведённые
другими организмами. Литотрофы — организмы, для которых донорами электронов,
необходимых для многих клеточных процессов,
являются неорганические вещества. Органотрофы — организмы,
для которых донорами электронов являются органические
вещества. Сапрофиты — это такие
гетеротрофные растительные организмы,
которые питаются за счет мертвого органического
вещества, извлекаемого из почвы (почвенные
грибы, бактерии), отмерших растений, из
готовой сельскохозяйственной продукции
(плесневые грибы, сапрофитные бактерии)
и т. п. Паразиты — это гетеротрофные
организмы, развивающиеся всю жизнь или
хотя бы часть ее на поверхности или внутри
других живых организмов и извлекающие
питательные вещества не из мертвых, а
из живых клеток.
Вопрос 2. Устройство микроскопа.
Оптическая схема. Принцип работы прибора.
Свойство микроскопа изображать объект
минимальных размеров называется его
разрешающей способностью. Она определяет
то наименьшее расстояние на котором два
рядом расположенных элемента структуры
могут еще быть видимы раздельно. Иммерсионным
называется объектив, в котором между
фронтальной линзой и препаратом помещают
каплю иммерсионного масла. Оптический
коэффициент иммерсионного масла близок
коэффициенту преломления стекла (1,52).
Вопрос 3. Streptococcus thermophilus. . Характеристика.
Систематическое положение. Применение.
Кокки в длинных цепочках, по величине
крупнее чем Str. Lactis, оптимальная темп.
40-45; сворачивает молоко за 12-14 часов; предел
кислотообразования 110-115 Т; составляют
остаточную микрофлору после пастеризации
молока; используются при производстве
простокваши, йогуртов, ряженки, варенца,
напитков с плодовоягодными наполнителями.
Билет 12
Вопрос 1. Способы культивирования
микроорганизмов.
Стационарный способ. При культивировании этим способом питательные
среды сохраняются постоянными, никаких
манипуляций с ними не производят. Преобладают
анаэробные энергетические процессы.
Выход биомассы незначителен. Для получения
большего выхода биомассы или биологически
активных соединений разработаны новые
методы.
Глубинный способ с аэрацией.
Глубинное культивирование проводят в
реакторах в герметичных котлах с жидкой
питательной средой, оборудованных автоматическими
приспособлениями для контроля рН, О2,
температуры, поступления стерильного
воздуха и т.д. (цв. вклейка, рис. VII). В аэробных
условиях достигается максимальное использование
энергии и максимальный выход биомассы.
Выход биомассы E.coli при культивировании
в стационарных условиях через 18 20 ч 1 млрд,
а при глубинном способе через 12 14 ч 50 60
млрд.
Проточный способ культивирования
позволяет клеткам длительное время находиться
в определенной фазе роста (экспоненциальной)
при постоянной концентрации питательных
веществ и в одних и тех же условиях, обеспечивающих
непрерывный рост культуры. Метод основан
на том, что в культивируемую суспензию
непрерывно добавляют свежую питательную
среду и одновременно удаляют соответствующее
количество бактерий.
Вопрос 2. Иммерсионная микроскопия.
Техника исследования. Возможности и ограничения
метода.
Иммерсионная микроскопия — метод микроскопического исследования
малых объектов с помощью погружения объектива светового
микроскопа в среду с высоким коэффициентом
преломления, расположенную между микроскопическим
препаратом и объективом.
Нанести на препарат небольшую каплю
иммерсионного масла. Повернуть револьвер
и установить (должен бьть щелчок) на центральной
оптической оси иммерсионный объектив
(90).
Наблюдая сбоку, погрузить иммерсионный
объектив в каплю масла почти соприкасаясь
линзой с предметным стеклом препарата.
Смотря в микроскоп, осторожно и медленно
поднимать тубус, вращать микрометрический
винт на себя (не отрывая объектива от
масла) появления контуров препарата.
После окончания работы микроскоп следует
обтереть тряпкой, а объективы(иммерсионные)
— мягкой тряпкой, слегка смоченной.
Вопрос 3. Bifidobacterium lactis. Характеристика.
Систематическое положение. Применение.
Грам(+), анаэробны, палочки слегка изогнуты
на концах поделены надвое, размер 2-5 мкм
, спор не образуют, обладают свойством
вытеснять из естественной микрофлоры
патогенные и условнопатогенные микроорганизмы,
восстанавливают равновесие кишечной
и влагалищной микрофлоры, нормализуют
пищеварение и защитные функции желудочно-кишечного
тракта.
Билет №13
1. Закономерности роста
культуры микроорганизмов при
периодическом культивировании
При внесении бактерий в питательную
среду они обычно растут до тех пор, пока
содержание какого-либо из необходимыхим
компонентов среды не достигнет минимума,
после чего рост прекращается. Если на
протяжении этого времени не добавлять
питательных веществ и не удалать конечных
продуктов обмена, то получим переодическую
культуру. Кривая описывающая зависимость
логарифма числа живых клеток от времени,
называется кривой роста.
Начальная фаза: охватывает промежуток времени между
инокуляцией и достижением максимальной
скорости деления. Продолжительность
зависит от предшествовавших условий
культивирования и возврата инокулята,
а также от того, насколько пригодна для
роста данная среда. Если инокулят взят
из старой культуры, то клеткам приходится
адаптироваться к новым условиям путем
синтеза РНК, образования рибосом и синтеза
ферментов. Если источники энергии и углерода
в новой среде отличаются от тех, какие
были в предшествующей культуре, то адаптация
может быть связана с синтезом ферментов.
Экспоненциальная фаза: характеризуется постоянной максимальной
скоростью деления клеток. Эта скорость
зависит от вида бактерий и среды. Величина
клеток и содержание в них белка у многих
бактерий остаются постоянными.
Стационарная фаза: наступает когда число клеток перестает
увеличиваться. Скорость роста зависит
от концентрации субстрата – при уменьшении
этой концентрации, ещё до полного использования
субстрата, она начинает снижаться. Скорость
роста может снижаться из-за нехватки
субстрата, большой плотности бактериальной
популяции, из-за низкого парциального
давления О2 или накопления
токсичных продуктов обмена.
Фаза отмирания: данная фаза и причины гибели клеток
в нормальных питательных средах изучены
недостаточно. число живых клеток может
снижаться экспоненциально. Иногда клетки
лизируются под действием собственных
ферментов (автолиз).
2. Виды микроскопии. Основные
принципы работы микроскопа.
1) Световая микроскопия;
2) Фазово-контрастная: основана на
специальных методиках с помощью которых
можно четко увидеть границу раздела фаз;
3) Темнопольная: применяется для исследования
внешних структур клетки (жгутиков, капсул,
чехлов)
4) Флуоресцентная: проводится в отсутствии
источников освещения с использованием
флуоресцентных красителей или ГМО. Иногда
препарат предварительно облучают светом
определенной длины волны
5) Электронная микроскопия: в этом методе
используется электронный микроскоп,
позволяет получить наибольшее увеличение
исследуемого объекта, до отдельных молекул.
Вместо пучка света используется пучок
электронов, по отклонению которых
на детекторе возникает картинка исследуемого
объекта. Электронный микроскоп снимает
ограничение на размеры исследуемого
объекта, который есть у оптического микроскопа.
Оптическая система микроскопа состоит
из основных элементов — объектива и окуляра.
Они закреплены в подвижном тубусе, расположенном
на металлическом основании, на котором
имеется предметный столик. Увеличение
оптического микроскопа без дополнительных
линз между объективом и окуляром равно
произведению их увеличений. В современном
микроскопе практически всегда есть осветительная
система, винты для настройки резкости.
3. Acetobacter orleanense
Палочки неправильной формы, аэробы,
спор не образуют, грамотрицательные.
Имеют жгутики, подвижны. Спиртоустойчивы,
кислотоустойчивы. Окисляют этанол до
уксусной кислоты. Образуют тонкую, сизую
пленку, со временем закрывающую всю поверхность
жидкой среды. Исторически первый вид,
используемый для получения уксуса. Фактор
роста: витамины, особенно пантотеновая
кислота.
Билет №14
1.Непрерывное культивирование.
Методы его проведения.
Сущность непрерывного культивирования
заключается в том, что в ферментаторе
поддерживаются постоянные условия среды,
в результате чего микроорганизмы остаются
в определенном физиологическом состоянии.
Подается свежая питательная среда и удаляется
избыток среды с продуктами метаболизма,
поддерживается фаза экспоненциального
роста. Если для культивирования продуцента
используется один ферментатор, то говорят
о гомогенно-непрерывном процессе. Если
же используется батарея, то это гетеро-непрерывный
процесс, так как в каждом ферментаторе,
соединенном в батарею, поддерживаются
постоянные условия. При непрерывном культивировании
микроорганизмов отсутствует смена фаз
развития культуры. В таких процессах
скорость потока питательной среды и отвода
культуральной жидкости из системы необходимо
отрегулировать, чтобы концентрация клеток
оставалась постоянной. В стерильных условиях
непрерывный метод обеспечивает сохранение
культуры в физиологически активном состоянии
длительное время. Поддержание динамики
равновесия в реакторе осуществляется
двумя методами: турбидостатным и хемостатным.
По турбидостатному принципу концентрация
биомассы поддерживается скоростью потока
среды, а по хемостатному – концентрацией
подаваемого субстрата. Известен также
способ регулирования роста культуры
по рН. При турбидостатном методе регулирования
контролируются концентрации суспензии
входящей жидкости, создаваемой микробными
клетками. Метод осуществляется с помощью
фотоэлемента или рН-электрода, если в
культуральной жидкости образуются органические
кислоты. Хемостатный контроль проще,
так как он происходит по входящему потоку.
Этот метод регулирования применим ко
всем типам микроорганизмов и клеток различных
тканей животных и растений. Биореактор
в хемостатном режиме снабжен устройствами
для вливания и выпуска питательной жидкости,
имеет систему контроля скорости потока,
перемешивание.