Получение лимонной кислоты микробиологическим путем

В собранной культуральной  жидкости содержится смесь органических кислот – лимонная, глюконовая, щавелевая  и неиспользованный сахар в примерном  соотношении 45-50:3:1:7, то есть лимонная кислота  составляет от 80 до 90%. Ее выделяют химическим путем – добавляют к нагретой до 100 ⁰С культуральной жидкости известковое молоко – Са(ОН)₂ или мел – СаСО₃, доводя рН до 6,8-7,0; это количество составляет примерно 2,5-3%; трехзамещённый кальция цитрат, хуже растворимый в горячей воде, чем в холодной, выпадает в осадок вместе с оксалатом кальция (кальция глюконат остается в растворе); осадок отфильтровывают, промывают горячей водой и гидролизуют серной кислотой. Свободная лимонная кислота остается в растворе, а негидролизованный оксалат кальция и образовавшийся гипс – CaSO4 остаются в осадке. Раствор лимонной кислоты очищают, подвергают вакуум-упариванию и кристаллизуют. Кристаллы кислоты высушивают и фасуют.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выбор способа ферментации

Процесс производства лимонной кислоты включает все основные стадии микробиологической технологии (рис. 3):

1. получение посевного материала;
2. подготовка сырья-мелассы к ферментации;
3. подготовка и стерилизация воздуха;
4. ферментация;
5. отделение биомассы продуцента — мицелия;
6. выделение из культурной жидкости лимонной кислоты и получение ее в кристаллическом виде.

 

В промышленном производстве лимонной кислоты применяется несколько  вариантов процесса.

Поверхностный способ ферментации

Приготовление питательной среды  при поверхностном способе культивирования  осуществляют в варочном котле. Мелассу разбавляют кипящей водой в соотношении 1:1 и, добавляя серную кислоту, доводят рН раствора до значения 6,7 – 7,2. Для осаждения солей железа и тяжелых металлов водят при кипячении определенное количество раствора желтой кровяной соли. В раствор мелассы при температуре 60 – 70 ⁰С последовательно добавляют источники азота, фосфора, макро- и микроэлементов. Содержание сахаров в среде должно составлять 12 – 16%.

Рис. 4. Технологическая схема  получения лимонной кислоты из мелассы  поверхностным способом (жидкофазная  ферментация): 1 - цистерна для мелассы, 2 - центробежные насосы, 3 - реактор для разбавления мелассы, 4 - стерилизатор, 5 - бродильная камера, 6 - сборник сбраживаемых растворов, 7 - нейтрализатор, 8, 10 - нутч-фильтры, 9 - расщепитель, 11 - сборник-монтежю, 12 - вакуум-аппарат, 13-дисольвер, 14 - фильтр-пресс, 15 - кристаллизатор, 16 - приемник, 17 - сушилка, 18 - готовая продукция, 19 - сборник фильтрата.

 

Основная ферментация осуществляется в специальных камерах, представляющих собой закрытые помещения, в которых  на стеллажах расположены кюветы. Кюветы прямоугольной формы изготавливают из алюминия или нержавеющей стали. Заполнение кювет питательной средой и слив из них культуральной жидкости осуществляется через щтуцеры в дне кювет. Камеры оборудованы системой для подачи нагретого стерильного воздуха.

Перед началом нового цикла ферментации  камеры и кюветы тщательно моют и  стерилизуют параформалиновой смесью с последующей дегазацией пароаммиачной смесью. После стерилизации и охлаждения камер в кюветы наливают питательную среду слоем от 12 до 18 см. с помощью специального устройства для распыления в питательную среду вносят посевной материал – конидии гриба A.niger.

Через сутки после засева образуется тонкая серовато-белая пленка мицелия, которая по истечении трех суток  сильно утолщается и приобретает  складчатую структуру. Температуру в период активного роста мицелия гриба поддерживают в предела 34 – 36 ⁰С при умеренной аэрации. В период активного кислотообразования температуру снижают до 32 – 34 ⁰С, а подачу воздуха увеличивают в 3 – 4 раза. По мере снижения интенсивности кислотообразования и уменьшения количества выделяемой теплоты подачу воздуха в камеру постепенно уменьшают. Процесс ферментации прекращают, когда в растворе остается 1 – 2% сахаров, а содержание кислот в культуральной жидкости достигает 12 – 20%.

Культуральную жидкость сливают из кювет в сборник, откуда ее подают в химический цех для выделения  лимонной кислоты. Содержание лимонной кислоты в культуральной жидкости составляет 12 – 20%.

Мицелий отмывают от кислоты горячей  водой и используют как корм для  скота.

Изложенный выше способ называют бессменным. По сменному способу после сливания культуральной жидкости под пленку A.niger вводят немного воды температурой 30 – 32 ⁰С, выдерживают 0,5 часов, промывную жидкость сливают, вводят свежую мелассную среду и ферментируют. По доливному способу ферментации на 4-5 сутки под пленку A.niger доливают свежую питательную среду в количестве, компенсирующем уменьшения объема вследствие испарения влаги. При работе этими способами экономится расход конидий, реже перезаряжаются камеры и появляется возможность ферментировать низкокачественные мелассы, не пригодные для выращивания грибной пленки.

Периодические способы имеют ряд  недостатков: ферментация происходит с небольшой скоростью; мицелий  по окончании цикла выбрасывают, хотя он еще активен, а получение  нового мицелия связано с затратой конидий, мелассы и времени на его выращивание; во всех кюветах  трудно поддерживать заданную температуру, поэтому ферментация происходит неравномерно.

Предложенные непрерывные способы  предусматривают протекание мелассной  среды по каскаду кювет под  предварительно выращенной пленкой  мицелия A.niger или под секциями его, движущимися на транспортере в одном направлении со средой в плоском ферментаторе туннельного типа.

Наряду с поверхностным способом ферментации на жидких средах за рубежом  известны способы ферментации на твердых средах. Твердофазная ферментация  предусматривает использование  импрегнированного средой пористого  твердого материала, как багасса, картофель, пульпа сахарной свеклы др. в определенных пропорциях. Материал стерилизуют и инокулируют суспензией спор. Инкубируют в лотках при 25 – 30 ⁰С в течение 6 – 7 дней. После инкубирования содержимое экстрагируют водой, концентрируют, цитрат осаждают и очищают.

В Японии в процессе Коджи получают пятую часть выпускаемой в  стране лимонной кислоты. Это твердофазное культивирование специальных штаммов A.niger на пшеничных отрубях. Перед стерилизацией значение рН отрубей доводят до 5,5, увлажняют отруби горячим паром так, чтобы их влажность составляла 70 – 80%. Далее субстрат охлаждают до 30 – 36 ⁰С и инокулируют спорами штамма, малочувствительного к присутствию Fe3+. Температура не должна быть выше 28 ⁰С. Крахмал отрубей осахаривается ферментами гриба, но добавление готовых ?-амилаз к субстрату увеличивает выход продукта. Инокулированные отруби размещают в лотках на глубину 3 – 5 см. через 5 – 8 дней Коджи собирают и переносят в инокулятор для экстракции лимонной кислоты водой. Загрязнение субстрата следовыми металлами является проблемой в процессе Коджи, так как их труднее удалять, чем в других вариантах процесса. Поэтому проводят селекцию и используют штаммы, устойчивые к следовым металлам. К субстрату также добавляют HCF или Сu⁺²

Глубинная ферментация

На современных заводах принято  глубинное культивирование гриба, характеризующее более высокой  продуктивностью, чем первый процесс. При этом инокулированная среда  наливается хорошо аэрируемые ферментеры с перемешиванием и контролем  аэрации. Глубинная ферментация  возможна в разных вариантах: периодическом  с подпиткой и непрерывном.

Рис. 5. Технологическая схема  получения лимонной кислоты при  глубинной ферментации продуцента: 1 - емкость с мелассой, 2 - приемник мелассы, 3 - весы, 4 - варочный котел, 5 - центробежный насос, 6 - промежуточная емкость, 7 - стерилизующая колонка, 8 - выдерживатель,9--холодильник, 10 - посевной аппарат, 11 - головной ферментатор, 12 - стерилизующие фильтры, 13 - емкость для хранения мелассы, 14 - промежуточный сборник, 15 - барабанный вакуум-фильтр, 16 - приемник для мицелия, 17 - вакуум-сборник для мицелия, 18 - вакуум-сборник фильтрата культуральной жидкости,

 

Процесс получения лимонной кислоты  при глубинном культивировании  гриба A.niger проводят в ферментаторах  объемом 100м³. В качестве посевного материала используют подросший мицелий, полученный в посевных аппаратах объемом 10 м³.

Раствор мелассы и для посевного, и для производственного ферментаторов  готовят также, как и при поверхностном  культивировании, только исходный раствор  мелассы для глубиной ферментации должен содержать не более 4% сахаров. По ходу ферментации, когда концентрация сахара резко снижается, проводят дробное добавление стерильного мелассного раствора, содержащего 25 – 28% сахаров. Добавляют этот раствор в таком количестве, чтобы концентрация сахаров в ферментаторе составляла 12 – 15%.

В посевной аппарат, заполненный питательной  средой, засевают суспензию конидий, которую предварительно выдерживают 5 – 6 часов в термостате при 32 ⁰С. Культуру выращивают при 34 – 35 ⁰С при постоянном перемешивании и аэрации. В процессе культивирования строго контролируют режим подачи воздуха в ферментатор, расход которого увеличивают к концу ферментации почти в 10 раз. О₂ должен находиться как минимум в концентрации 20 – 25% от насыщения. В период интенсивного вспенивания среды небольшими порциями вводят химический пеногаситель (олеиновую кислоту). Процесс подращивания мицелия заканчивают через 30—36 ч, когда содержание кислот в культуральной жидкости достигает 1—2%. Подросший мицелий передают для засева питательной среды в производственный ферментатор.

Процесс кислотообразования в ферментаторе продолжается 5—7 сут при непрерывной  аэрации и температуре 31—32 ⁰С. Расход воздуха постепенно увеличивают с 400 м³/ч в начале процесса до 2200 м³/ч к концу ферментации. Дробную добавку подливного раствора проводят 2—3 раза, поддерживая концентрацию Сахаров, в растворе в пределах 12—15%. Конец процесса определяют по общей кислотности и концентрации сахаров.

После окончания процесса ферментации  культуральную жидкость нагревают острым паром до 60—65 ⁰С и сливают в сборник, а оттуда подают на вакуум-фильтр для отделения и промывки биомассы мицелия. Промытый мицелий используется как корм для скота. Основной раствор лимонной кислоты вместе с промывными водами передается в химический цех для выделения лимонной кислоты.

Отъемно-долевной способ ферментации заключается в том, что при активно протекающем процессе продолжают подливать мелассную среду с соответствующими предварительными отъемами жидкости. В начале ферментацию ведут по режиму, обычно для периодического способа, затем в 3 – 4 приема или непрерывно подливают дополнительное количество среды. Подлив прекращают за 36 часов до конца процесса ферментации, продолжающийся 12 суток. Суммарное количество сахара за цикл составляет около 30% в пересчете на исходный объем (при начальной 3%-ной концентрации). В период дополнительных подливов поддерживают 1,2 – 1,5%-ную концентрацию сахара. Перед каждым подливом добавляют столько воды, сколько ее увлечено отработавшим сжатым воздухом, и небольшого количества азота.

При ферментации отъемно-долевным способом увеличивается среднесуточный съем лимонной кислоты с 1 м³ ферментатора за счет уменьшения частоты его зарядок при том же выходе кислоты по массе сахара.

Непрерывный способ ферментации. Сотрудниками Ленинградского завода лимонной кислоты испытан способ непрерывной ферментации в одном аппарате. Когда концентрация сахара в культуральной жидкости в условиях, характерных для периодического способа, понизится до 0,2 – 0,5%, приступают к непрерывной подаче мелассной среды концентрацией 20 – 25% по сахару в таком количестве, чтобы концентрация сахара постоянно находилась в пределах 0,2 – 0,5% и культуральная жидкость непрерывно отбиралась.

Отмечено, что в процессе непрерывной  ферментации A.niger изменяет морфологию и проявляет большую кислотообразующую  способность, что в периодическом. Недостатком непрерывной ыерментации  в одном аппарате является проскок  неферментированного сахара и невозможность осуществления профилактической стерилизации без прерывания процесса. Проведение ферментации в нескольких последовательно соединенных аппаратах не имеет этих недостатков и более перспективно, о чем свидетельствует опыт непрерывного спиртового брожения.

Сравнение глубинного и поверхностного способа ферментации

При одинаковой мощности заводов капитальные  затраты на строительство зданий ферментационных цехов примерно в два раза больше при поверхностном способе ферментации главным образом из-за постройки камер. Стоимость же оборудования для него, наоборот, в 1,3—1,5 раза меньше и большая часть его изготовляется на месте. Общие единовременные затраты на здания и оборудование для глубинного способа на 20—30 % меньше при большей величине быстро изнашиваемого оборудования.

Затраты на электроэнергию при глубинном  способе ферментации в несколько  раз выше. Энергия тратится в основном на получение сжатого воздуха. При  поверхностном способе ферментации  воздух подается под очень небольшим  давлением и расход его меньше. Затраты на обслуживающий персонал несколько больше при поверхностном способе, так как подготовка камер и снятие мицелия с кювет требуют больших затрат ручного труда.

Себестоимость лимонной кислоты несколько  ниже при поверхностном способе ферментации. Этот способ имеет и другие преимущества: выше концентрация лимонной кислоты в культуральной жидкости, значительно меньше образуется побочных кислот, вследствие чего затрачивается меньше мелассы при ферментации и меньше потери при химической переработке культуральных жидкостей. При поверхностном способе гриб менее чувствителен к перерывам в аэрации. Обслуживание и контроль процесса ферментации просты, проблемы возникают только при необходимости поддержания требующейся температуры воздуха в камере при высокой температуре наружного воздуха (в районах с жарким летом).