Получение лимонной кислоты микробиологическим путем

Фермент аконитаза, участвующий  в расщеплении цитрата в ЦТК, снижает его продукцию. Считали, что при дефиците Fe или при  добавлении Cu происходит ингибирование  аконитазы и соответственно увеличение выхода цитрата. Однако аконитаза катализирует реакцию, сильно сдвинутую в сторону образования цитрата, и необходимости в ее ингибировании нет. Другой фермент – НАДФН-зависимая изоцитратдегидрогеназа, которая теоретически должна способствовать снижению аккумуляции лимонной кислоты, ингибируется цитратом. Правда, у А. niger имеется еще один аллостерически НАД-связанный фермент – изоцитратдегидрогеназа, которая активируется цитратом.

Выход лимонной кислоты зависит  от активности α-кетоглутаратдегидрогеназы. Образование сукцинил-КоА из α-кетоглутарата под действием α-кетоглутаратдегидрогеназы называют узким местом ЦТК. Фермент ингибируется физиологической концентрацией щавелевоуксусной кислоты и НАДН. Увеличение клеточного оксалоацетата снижает катаболизм цитрата на уровне α-кетоглутарата и одновременно усиливает скорость его синтеза при участии цитратсинтазы. Аккумуляция α-кетоглутарата и НАДН снижает активность НАД(НАДФ)-изоцитратдегидогеназы, что способствует увеличению накопления цитрата до уровня, при котором сам ингибирует вышеуказанный фермент.

Цитрат сильно ингибирует транспорт глюкозы в клетке путем  подавления активности фосфофруктокеназы. Последнему противодействует увеличение концентрации NH₄⁺, а накоплению NH₄⁺ способствует дефицит Mn в среде. Полагают, что при дефиците Mn усиливается разложение белков и внутриклеточное содержание NH₄⁺ возрастает. Повышение концентрации аммонийных ионов внутри клеток смягчает ингибирующее влияние цитрата на фосфофруктокиназу.

Большинство исследователей склоняется к мнению, что основную роль играет ингибирование ферментов — аконитатгидратазы и изоцитратдегидрогеназы. Ингибирование аконитатгидратазы объясняют действием самой лимонной кислоты или избытка гексацианоферроата калия, применяемого для обработки мелассных сред перед ферментацией.

При интенсивном кислотообразовании активность цитратсинтетазы возрастает приблизительно в десять раз. Однако по имеющимся данным еще нельзя решить вопрос, что является причиной накопления лимонной кислоты — ингибирование указанных двух ферментов или активирование цитратсинтетазы.

Известно, что ко вторым суткам ферментации в среде, уже покрытой тонкой мицелиальной пленкой, в ощутимых количествах содержатся янтарная и яблочная кислоты, а также не относящиеся к ЦТК кислоты: глюконовая, сахарная и малоновая. Первые две кислоты образуются непосредственным окислением глюкозы, малоновая, по-видимому, как промежуточный продукт на пути синтеза насыщенных жирных кислот:

         +СО2

Ацетил-КоА  >   Малонил-КоА   >   Малонат

Содержание всех этих кислот возрастает до третьих—пятых суток  ферментации. Таким образом, ингибирование  аконитатгидратазы и изоцитратдегидрогеназы начинают вызывать перечисленные выше кислоты, что вызывает постепенное накопление лимонной кислоты, которая в свою очередь еще больше ингибирует данные ферменты, и усиливает их синтез.

Следует обратить внимание еще на одного возможного участника  в этом механизме — малоновую  кислоту, являющуюся специфическим  ингибитором сукцинатдегидрогеназы. Малоновая кислота образуется больше других кислот и содержание ее в  среде возрастает до четвертых-пятых  суток — времени начала наиболее интенсивного продуцирования лимонной кислоты.

В период интенсивного накопления лимонной кислоты в ЦТК преобладает  анаплеротический путь метаболизма, т.е. сначала происходит карбоксилирование пировиноградной кислоты с образованием щавелевоуксусной, а затем конденсация ее с ацетил-КоА. Интенсивность образования лимонной кислоты в этот период может быть понятна также из того, что в данном случае резко ограничиваются возможности конструктивного и энергетического обмена веществ клетки и A.niger для поддержания жизнеспособности вынужден перерабатывать значительно большее количество субстрата.

Фактором, стимулирующим  аккумуляцию лимонной кислоты, служит аэрация: глюкоза+3/2 О₂ > лимонная кислота+2Н₂О. О₂ необходим и для реокисления гликолитического НАДН в процессе лимоннокислой ферментации.

Технологическая схема.

В отдельном цехе осуществляют наработку спор (конидий) гриба в  виде трехстадийной схемы. В первую стадию A.niger выращивают на скошенной  агаризованной среде (например, на сусло-агаре) в пробирках, во вторую и третью стадии его размножают на плотной или жидкой среде соответственно в колбах Эрленмейера или в алюминиевых кюветах площадью 8,5-12 дм² и с высотой бортиков от 7 до 20 см. Продолжительность каждой стадии - от 2 до 4 суток при температуре 32⁰С. При образовании и созревании конидий вначале бесцветный мицелий становится затем черным; конидии собирают по принципу аспирации (по лат. aspiratio - вдыхание, надувание) специальным вакуумным насосом, подсушивают в термокамере при 28-30 ⁰С, смешивают со стерильным активированным углем (1:2), фасуют в стерильные флаконы (колбы) и хранят в течение от полутора до двух лет. С 10 дм² питательной среды в кюветах можно получить до 4-5 г сухих конидий. Подобный посевной материал может быть самостоятельным коммерческим продуктом, поставляемым на заводы лимонной кислоты.

В варочном аппарате 5 при  работающей мешалке растворяют отвешенное количество мелассы в кипящей воде (соотношение 1:1). При содержании в мелассе кальция более 0,4% СаО избыток его осаждают ЩКА, кипятят 5 – 10 минут, добавляют серную кислоту или кальцинированную соду, необходимые для установления рН в пределах 6,8 – 7,2. Затем прибавляют раствор гексоцианоферроата, снова кипятят 5 – 10 минут, проверяют на содержание свободного гесоцианоферроата и проводят корректировку. При обработке мелассных растворов трилоном Б заменяют от20 до 40% гексоцианоферроата калия. Применение трилона повышает выход лимонной кислоты примерно на 15%. При внесении в среду трилона Б рН ее понижается на 0,2 – 0,3 ид., что необходимо учитывать.

Далее вводят растворы хлорида  аммония и сульфата магния, доводят  водой до объема среды, соответствующего 3%-ной концентрации, нагревают до кипения и насосом 2 перекачивают на стерилизационную установку непрерывного действия.

Стерилизационная установка  состоит из стерилизационной колонки 6, выдерживателя 7 и холодильника типа «труба в трубе» 8. Стерилизационная колонка имеет 2 трубы – наружную и внутреннюю. Пар подается по внутренней трубе со щелевидными прорезями, через которые он поступает в питательную среду. Среда подается снизу, движение ее происходит по спирали благодаря наличию винтовых направляющих.

Стерилизацию ведут при  температуре 122 – 124 ⁰С; стерилизуемая среда поступает в выдерживатель на 10 – 15 минут, а затем минуя холодильник, поступает в посевной ферментатор 9. Приготовление среды завершается в посевном ферментаторе. В нее при работающей мешалке и температуре 70 – 80 ⁰С вводят из инокулятора через посевной штуцер антимикробный раствор, охлаждают через рубашку ферментатора водой до 35 – 36 ⁰С и затем вводят стерильные растворы КН₂РО₄ и ZnSO₄. Контролируют рН готового раствора (6,8 – 7,2) и в необходимых случаях корректируют его добавлением серной кислоты или стерильного раствора соды.

В посевной ферментатор 9 к  подготовленному раствору температурой 35 – 36 ⁰С через инокулятор вводят суспензию конидий, которую готовят за 5 – 6 часов. Предварительно определенное количество сухих конидий замачивают в небольшом объеме мелассной среды и выдерживают при 32 ⁰С в термостате. С целью активирования конидий (ускорение их прорастания и усиления кислотообразования) иногда добавляют препараты, содержащие набор микроэлементов, продукты метанового термофильного брожения, обрабатывают малыми дозами мутагенов или применяют другие способы.

Рис.3 Технологическая схема  производства лимонной кислоты

После засева в ферментатор  сразу подают стерильный воздух и  включают в работу лопастную мешалку с частотой вращения 180 об/мин. Аэрацию и перемешивание раствора ведут в течение всего времени приготовления посевного материала при избыточном давлении 0,02 – 0,03 МПа. Температуру 34 – 35 ⁰С поддерживают охлаждением водой через рубашку ферментатора. В посевном ферментаторе объемом 10 м³ в первые шесть часов, когда конидии набухают и начинают прорастать, достаточно небольшого расхода воздуха 9 – 10 м³/ч. в следующие 7- 11 ч количество воздуха постепенно увеличивают до 18 м³/ч и через 12 ч до 36 м³/ч. в 10 – 12-часовом мицелии в центральных участках гиф появляются первые поперечные перегородки и начинается ветвления.

С этого времени происходит сильное вспенивание культуральной  среды, поэтому в патрубок для посева вводят 25 – 30 мл стерилизованной технической олеиновой кислоты (группы А или Б по ГОСТ 10475 – 63), которая содержит не менее 92%жирных кислот в безводном продукте, не более 0,25% влаги и имеет температуру застывания 10 – 16 ⁰С.

Если через некоторое  время культуральная жидкость начинает вновь пениться, вводят еще пеногаситель, так как при активном росте  мицелия расход воздуха уменьшать  нельзя.

К 16 – 19 ч подают 45 м³ воздуха в 1 ч; к 20 – 24 ч, когда вырастает значительная масса мицелия, пенообразование обычно прекращается. Объем раствора заметно увеличивается за счет образовавшегося мицелия и мелких пузырьков воздуха, жидкость становится густой и светлой. С этого времени подают в ферментатор 70 – 72 м³ воздуха в 1 ч. После 24 – 30 ч количество подаваемого воздуха увеличивают до 90 м³/ч и до конца процесса поддерживают на уровне 90 – 100 м³/ч.

Готовая 28 – 36-часовая культура должна быть светлой, молочно-бежевой, насыщенной пузырьками воздуха со всплывающим  мицелием. Мицелий – хлопьевидный, диффузный, содержащий немного мелких шарообразных комочков. Гифы – светлые, тонкие, вытянутые, активно ветвящиеся, со светлой прозрачной цитоплазмой, расположенной в пристенном слое; в центральной части клетки расположена большая вакуоль; общая (титруемая) кислотность – около 0,7 – 2,0 %.

Процесс формирования мицелия  и чистоту культуры контролируют микроскопированием проб. Присутствие  посторонней микрофлоры недопустимо. Патологический мицелий образуется при нарушении технологического режима выращивания и при инфицировании посторонними микроорганизмами, что легче выявляется в 12-часовых пробах.

Мелассную среду в основном ферментаторе 11 засевают подросшим  мицелием. Способ перемешивания ферментируемой среды в основном ферментаторе –  эрлифтный. Приготовление мелассной среды в основном ферментаторе 11 проводят следующим образом. В варочном аппарате 5 кипятят водопроводную воду и направляют ее в стерилизационную установку, где стерилизуют при температуре 128 – 130 ⁰С и после охлаждения переводят в ферментатор. Затем в варочном аппарате 5 готовят мелассный раствор. Мелассу разбавляют водой в соотношении 1:1 и обрабатывают горячий раствор ЩКА, как обычно. Раствор кипятят 5 – 10 минут, доводят рН до 6,8 – 7,2, кипятят 10 – 20 минут и обрабатывают раствором гексоцинофероатом калия, после чего кипятят еще 5 – 10 минут и проверяют на содержание свободного гексоцианоферроата. Проверяют и корректируют рН в пределах 6,8 – 7,2. Мелассная среда, пройдя стерилизационную установку, поступает в ферментатор. Здесь среду разбавляют стерильной водой до объема 60 м³ с учетом внесения посевного мицелия. Концентрация сахара в среде должна быть около 3%, температура 32 – 34 ⁰С. При непрерывной подаче воздуха через стерилизационную установку последовательно вводят (при объеме ферментатора 100 м³) 9 м³ горячей воды температурой 126 – 129 ⁰С, 9 м³ воды температурой 32 – 34 ⁰С, 6 – 10 м³ стерильных растворов питательных солей температурой 32 – 34 ⁰С, 6 – 10 м³ горячей воды, 8 – 8 м³ мелассного раствора и охлажденную воду в количестве, необходимом для доведения объема исходного мелассного раствора до 54 м³.

Во время заполнения ферментатора содержимое его охлаждают водой  до температуры 32 – 33 оС. Затем по пропаренной  коммуникации из посевного ферментатора 9 переводят приготовленную посевную культуру, при этом объем содержимого  в основном ферментаторе 11 увеличивается до 60 м³. Его перемешивают 30 минут отбирают пробу для определения рН, концентрации сахара и микробиологической чистоты. После зарядки ферментатора все продуктовые коммуникации промывают стерильной горячей водой и пропаривают 1 час.

Аэрацию и перемешивание  в эрлифтных ферментаторах следует  рассматривать как единый процесс, так как нельзя аэрировать среду, не вызывая ее перемешивания. При перемешивании раствор вспенивается. Это вызвано присутствием в питательной среде сапонина, азотистых веществ и пектинов. В ферментеры подают сжатый воздух, который предварительно проходит через стерилизационные фильтры 10.

Через сутки после засева, когда подросший мицелий разрастается и начинается интенсивное образование лимонной кислоты, проводят подливы более концентрированной мелассной среды (20 – 25% по сахару). Среду подливают периодически (по 5 – 20 л в один прием на 1 м³ геометрического объема) или непрерывно до заполнения объема ферментатора примерно на 80%. Подливы обычно начинают, когда в культуральной жидкости общая кислотность достигнет 1,5 – 2%, а содержание сахара уменьшится до 0,4 – 0,8%. В дальнейшем концентрацию сахара поддерживают на уровне 0,8 – 1,2%.

Подливы проводят с интервалами  по 1,5 часа и заканчивают на третьи сутки от начала ферментации. Суммарная  концентрация сахара составляет 12 – 13% в расчете на исходный объем среды в ферментаторе (60 м³ в 100 м³ ферментаторе). После подливов ферментируемая среда сильно пенится, поэтому в нее добавляют немного пеногасителя. Если по окончании подливов образуется много мицелия и среда становится очень густой, в ферментатор доливают немного стерильной воды.

При каждом периодическом  подливе концентрация сахара в среде  возрастает и требуется определенное время, чтобы гриб адаптировался  к ней и продолжал продуцировать  кислоту. При непрерывных подливах концентрация сахара на значительном отрезке времен остается практически постоянной, обеспечивая непрерывное кислотообразование и сокращение длительности цикла ферментации.

Если титруемая кислотность  в двух пробах, взятых в конце  ферментации, с интервалом 4 – 8 ч, не нарастает, то ферментацию заканчивают. Прекращают подачу воздуха, нагревают  культуральную жидкость паром до 65 – 70 ⁰С и переводят в сборник 13.

Отделение мицелия и отмывку  от него лимонной кислоты проводят на барабанных вакуум-фильтрах 14 непрерывного действия. Культуральную жидкость из приемного сборника 13 центробежным насосом 3 передают в корыто вакуум-фильтра, где мицелий отделяют. Культуральный раствор собирают в сборнике 16, а мицелий – в сборнике 15. Фильтрат из сборника 14 подают на химическую обработку, а промытый мицелий удаляют. Содержание кислоты в отмытом мицелии не должно превышать 0,2.