Получение лимонной кислоты микробиологическим путем

Введение.

Одной из важнейших органических кислот, получаемых путем микробиологического  синтеза, является лимонная кислота. Большая ее часть используется в пищевой промышленности, в производстве напитков, кондитерских изделий, сиропов и т.д., а также в фармацевтической промышленности и для технических целей. Растущая потребность в лимонной кислоте, составляющая только для России десятки тысяч тонн, требует новых, более интенсивных и эффективных способов ее получения, также выделения и очистки [1-3].

Рентабельность основного  производства лимонной кислоты резко  возрастает при расширении дополнительной номенклатуры продукции, в частности солей и эфиров лимонной кислоты. Их применение в пищевой промышленности разнообразна: продукты детского и диетического питания, приготовление фруктовых консервов, желе, сухих напитков, фруктового мороженого, а также моющих средств. Перспективными программами научно-технического прогресса предусматриваются разработки технологий получения цитратов калия и натрия. Ассортимент солей лимонной кислоты составляет более 30 наименований, причем большинство из них пользуется значительным спросом и нуждается в развитии производства на промышленной основе. Весьма перспективны поставки солей лимонной кислоты за рубеж, где их стоимость в 5-10 раз превышает стоимость лимонной кислоты. Эффективная организация таких производств требует перехода на новые прогрессивные технологии и новые высокопродуктивные типы основного технологического оборудования.

Перспективы совершенствования  лимонной кислоты состоят в следующем. Во-первых, необходимо расширить сырьевую базу для получения лимонной кислоты  и перейти на технологические  процессы переработки новых видов  сырья, экологически более чистых по сравнению с традиционно используемой мелассой: полупродукты сахарного и  крахмалопаточного производства, гидролизаты крахмала, спирта, концентрированные соки сахаросодержащих растений. Применение нового углеводсодержащего сырья имеет ряд преимуществ, что прежде всего выражается в стабильности процесса и высоком выходе лимонной кислоты. Кроме того, оно позволяет отказаться от использования наиболее опасного в экологическом отношении комплексообразования - гексацианоферрата калия.

В природе лимонная кислота встречается  довольно часто, главным образом  в незрелых плодах цитрусовых, ананасов, груш, инжира, брусники, клюквы и др. Лимоны и апельсины были главными источниками естественной (растительной) лимонной кислоты, которую производили преимущественно в Италии, где в середине XIX в. начали действовать первые заводы по производству кристаллической лимонной кислоты. Затем аналогичные заводы начали действовать в Калифорнии (США), на Гавайских островах и в Вест-Индии.

Для получения лимонной кислоты  путем микробного синтеза в лабораторных условиях использовали микромицеты (Aspergillus clavatus, Penicillium luteum, P. citricum, Mucor piriformis, Ustina vulgaris и др.), но для промышленного  биосинтеза наиболее подходящим оказался Aspergillus niger. Впоследствии из него было селекционировано множество производственных штаммов для биосинтеза лимонной кислоты из сахарозы.

Многие органические вещества сбраживаются микромицетами и могут быть трансформированы в лимонную кислоту, но максимальный выход получается при биосинтезе из сахарозы или фруктозы. В последнее время успешно завершены эксперименты по биосинтезу лимонной кислоты дрожжами (Candida lipolytica и др.) из парафинов и низших спиртов (этанола) с высоким выходом (80—140%).

Лимонная кислота по объему производства является одним из главных продуктов  микробного синтеза. Ее общий выпуск в различных странах достигает 400 тыс. т в год (по данным В. А. Смирнова, 1983). Лимонную кислоту получают в основном из мелассы. Заводы небольшой или средней мощности производят лимонную кислоту поверхностным методом культивирования. Глубинный метод экономически выгоден тогда, когда мощность завода превышает 2500 т лимонной кислоты в год.

Лимонную кислоту широко используют в кулинарии и в пищевой промышленности для приготовления безалкогольных напитков, мармелада, вафель, пастилы и др. Лимонная кислота включена в рецептуры некоторых сортов колбас и сыра, ее применяют в виноделии, для рафинирования растительных масел, для производства сгущенного молока. С помощью лимонной кислоты сохраняются естественные вкус и аромат при длительном хранении в замороженном состоянии мяса и рыбы.

При умеренном употреблении лимонная кислота стимулирует деятельность поджелудочной железы, возбуждает аппетит, способствует усвоению пищи.

Натриевые соли лимонной кислоты стимулируют  вспенивание и механическую устойчивость пен, поэтому лимонную кислоту ценят кулинары, ее также применяют для изготовления шампуней и моющих средств. Последнее имеет важное экологическое значение, так как лимонная кислота и ее соли легко поддаются микробиологической деградации при очистке канализационных вод.

Применение находят и побочные продукты ферментации: мицелий грибов и культуральная жидкость. Мицелий высушивают и используют как сырье или добавляют к удобрениям. Недавно предложено использование мицелия как источника хитина, который служит биосорбентом. Хитозан – глюкановый комплекс, полученный их мицелия, обладает лучшими хелатирующими свойствами, чем хитозан животных. В культуральной жидкости обнаружены гидролитические ферменты пектиназа, протеаза, целюлаза и β-глюкозидаза.

Основные способы производства и сырье.

Общепризнано, что производство лимонной кислоты химическими способами  экономически нецелесообразно: стоимость сырья значительно выше стоимости мелассы; технология многостадийна, требует применения сильно токсичных реагентов и дает относительно низкий выход целевого продукта. Поэтому не удивительно, что, несмотря на большой прогресс в области химического синтеза различных органических соединений, такие сравнительно простые вещества, как лимонная, молочная и некоторые другие кислоты, до сих пор вырабатывают из сахаросодержащегося сырья с помощью микроорганизмов. Преимущества микробного способа в последовательном ферментативном осуществлении в клетке даже значительно большего числа химических реакций в одну производственную стадию – ферментацию. Это упрощает технологию, увеличивает выход кислот и снижает их себестоимость.

В качестве сырья для ферментативного  получения лимонной кислоты в  большинстве стран используют мелассу  – побочный продукт производства сахара из сахарной свеклы или сахарного  тростника.

В США «Miles Laboratories, Inc.» перерабатывает глюкозные сиропы, получаемые ферменативным гидролизом кукурузного крахмала, во Франции завод фирмы «Melle – Bezons» - кристаллический сахар (сахарозу). Исследована возможность применения и других видов сырья. Еще в начале ХХ века В.С. Буткевич показал, что лимонная кислота может образовываться при культивировании Aspergillus niger на растворах уксусной кислоты, ацетатов, метилового и этилового спирта как единственных источников углерода. Позднее другими исследователями предложены н-парафины, а в качестве продуцента – дрожжи рода Candida.

В расчете на дешевую арабскую нефть  в ряде стран большая надежда  возлагалась на н-парафины – один из продуктов ее переработки. Однако ввиду истощения запасов и  повышения цен на нефть, относительно небольшого выход парафинов и необходимости их использования в других направлениях они вскоре перестали быть перспективным сырьем. Синтетические спирты уксусную кислоту получают на основе переработки попутных газов нефти и собственно природных газов; источники их не безграничны, к тому же эти виды сырья, как н-парафины, широко используются в отраслях народного хозяйства. При ферментации парафинов, спиртов и уксусной кислоты дрожжами одновременно с лимонной кислотой в значительных количествах образуется изолимонная, чем снижается выход целевого продукта и возникает дополнительная проблема их разделения.

Как источник сырья гораздо надежнее и дешевле побочные продукты переработки  растительного сырья, ежегодно возобновляемого в больших количествах. Это прежде всего относится к сахароносам (сахарная свекла и сахарный тростник), дающим сахарный сок, или, при переработки его на кристаллический сахар, мелассу, и в некоторой мере – к крахмалоносам (кукуруза, картофель), к растительным отходам сельского хозяйства и механической переработки древесины.

Меласса как исходное сырье.

Для промышленного производства лимонной кислоты в качестве субстрата  применяют мелассу – отход  сахарного производства.

Меласса — оттек (маточный раствор), получающийся при отделении кристаллов сахарозы на центрифугах от последней кристаллизации. В мелассе содержатся несахара сока сахарной свеклы или сахарного тростника, не удаляемые при его химической очистке, и сахароза, которую методом кристаллизации выделять уже экономически невыгодно. При выработке сахара выход мелассы в расчете на безводную колеблется от 3 до 6% к массе сахарной свеклы. С мелассой отходит от 10 до 15% всего сахара, содержащегося в перерабатываемой свекле.

В соответствии с видом исходного  сырья для производства сахара различают  свекловичную и тростниковую мелассу. В России сахарный тростник не произрастает, но на свеклосахарных и сахарорафинадных заводах перерабатывают импортный тростниковый сахар-сырец на белый сахар-песок и сахар-рафинад. В первом случае получаемую мелассу называют сырцовой; во втором случае, независимо от исходного сырья,— рафинадной патокой. Производство мелассы в России составляет около 4,5 млн. т в год.

Химический состав свекловичной мелассы.

По внешнему виду свекловичная меласса  представляет собой густую вязкую жидкость темно-коричневого цвета со специфическим  запахом, обусловленным в основном присутствием триметиламина и диметилсульфида. Это — лучшее сырье для производства. Ценность его заключается в том, что наряду с высоким содержанием сахара в мелассе содержатся все вещества, необходимые для нормальной жизнедеятельности гриба. Выход лимонной кислоты при использовании ее — наибольший.

Меласса имеет сложный и непостоянный химический состав, зависящий от почвенно-климатических  условий вегетации свеклы, вносимых удобрений, способов уборки, условий и продолжительности хранения, технологии сахароварения и др. Например, механизированная уборка свеклы, транспортировка, доочистка и складирование травмируют корни, способствуя их загниванию при хранении. Корни с не полностью обрезанными головками склонны к прорастанию. Все это ухудшает качество свеклы и мелассы.

В мелассе содержится в среднем 80% сухих веществ и 20% воды. Учитывая состав мелассы, можно предполагать, что значительная часть воды находится в связанном состоянии вследствие гидратации в растворе коллоидов, молекул сахарозы и ионов минеральных веществ.

Сухие вещества. Общее содержание сухих веществ в мелассе непосредственно после фуговки утфеля на сахарном заводе составляет около 85% - реализуемая (товарная) меласса имеет несколько меньшую концентрацию, так как разбавляется водой и конденсатом при промывании и пропаривании трубопроводов, по которым она транспортируется в баки-хранилища. Снижение концентрации препятствует образованию кристаллов сахара при хранении, уменьшает вязкость, что облегчает отгрузку мелассы, особенно в холодное время года, и зачистку баков.

Сухие вещества мелассы слагаются  из следующих компонентов (в среднем, % масс.): сахарозы 60,0, безазотистых органических веществ 16,7, азотистых веществ 14,8, и минеральных веществ (золы) 8,5. В свеклосахарном производстве учет ведут по сахарозе – основному продукту, в соответствии с чем другие сахара, полностью или частично используемые грибом, и сумму их называют «ферментируемые сахара».

В качестве минеральных веществ  в мелассе содержится около 40% К₂О, от 1,5 до 4,5 % MgO и 7,3 – 13,8% СаО к массе золы.

Около 97% содержащегося в свекле фосфора теряется в процессе сахарного  производства (осаждается в основанном на дефекации). При переработке здоровой сахарной свеклы с нормальной натуральной  щелочностью в чистой золе содержится 0,2 – 0,6% Р₂О₅, или 0,02 – 0,06% к массе мелассы.

В мелассе присутствуют микроэлементы, количество которых сильно колеблется, что может отражаться как на росте гриба, так и на выходе лимонной кислоты. Элементы – алюминий, железо, кремний и стронций – могут содержаться как в макро-, так и в микроколичествах.

Меласса, пригодная для производства лимонной кислоты, должна удовлетворять  следующим требованиям: содержать сухих веществ не менее 75%; сахара по прямой поляризации не менее 46%; инвертного сахара не более 1%; окиси кальция не более 0,7%; диоксида серы не более 0,03%; Р₂О₅ не более 0,05%; жироподобных веществ не более 0,5%. Величина рН должна быть на ниже 6,5. Перечисленные показатели технологического качества мелассы, однако, еще не могут служить надежным критерием ее пригодности для производства лимонной кислоты, и окончательное заключение об этом может быть сделано только по результатам биохимического испытания (опытной ферментации).

Заготовка мелассных сред.

Мелассу заготавливают на сахарных заводах на основании предварительных  испытаний по ферментации, в конце  сентября – ноябре. Меласса, заготовленная  в более поздние сроки, обычно характеризуется пониженным выходом лимонной кислоты. Заготавливают мелассу исходя из 15-месячного запаса.

Меласса считается пригодной для  производства лимонной кислоты, если в  оптимальных условиях подготовки и  ферментации в поверхностных  условиях (в стаканах с площадью дна 0,42 дм², концентрации сахара 15%, высоте слоя 9см, продолжительности ферментации 7сут и соответствующем штамме – поверхностном или глубинном) будет получен съем: на мелассе для глубинной ферментации не менее 1800г/(м², сут), для подливов – не менее 1500; на мелассе для поверхностной ферментации – не менее 1400г/(м², сут).

Так как процесс биохимической  оценки качества меласс очень длителен, то для поверхностного способа производства лимонной кислоты предложены ускоренные методы: по накоплению инвертного сахара в среде на вторые сутки ферментации и по величине съема на третьи сутки для штаммов Р-l и Р-3. Математическая обработка экспериментальных данных по первому методу подтвердила линейную зависимость, подчиняющуюся уравнению: