Получение лимонной кислоты микробиологическим путем

у = 57,6 + 15,2х,

где у - прогнозируемый съем лимонной кислоты, г/(м²·сут); х – концентрация инвертного сахара в мелассной среде через двое суток после начала ферментации, г/л.

При наличии на вторые сутки ферментации  в культуральной жидкости не менее 90г инвертного сахара в 1л возможен съем, удовлетворяющий требованиям к мелассе.

Второй метод дал также хорошие  результаты. Съем лимонной кислоты  на седьмые у и на третьи сутки х ферментации выражается уравнением:

у = 526 + 1,03х.

Достаточно высокий коэффициент  корреляции (0,885) свидетельствует о тесной связи между у и х. Точность прогнозирования по первому и последнему методам ±10%.

Стерилизация мелассных  сред.

При возникновения производства лимонной кислоты предполагали, что благодаря  сильному подкислению среды во время ферментации не следует бояться инфекции. Однако, вскоре выяснилось, что это не так и обсеменение посторонними микроорганизмами наносит вред производству.

Наиболее надежным и экономичным  способом стерилизации является тепловая – насыщенным водяным паром. Температура должна быть выше летальной для наиболее стойких споровых форм. При преобладании спороносящих бактерий выдерживают температуру 125-130⁰С и экспозицию не меньше 30мин. Нужно добиваться уничтожения всех микроорганизмов (стерильности) среды, но так как в производстве это очень трудно, то для оставшегося пренебрежимо малого (технически допустимого) количества микрофлоры, а также для посторонних микроорганизмов, случайно попавших со сжатым воздухом и другими путями, создают неблагоприятные для развития условия добавлением в среду антимикробных веществ, т.е. проводят защищенную ферментацию.

Формалина, обычно применяемого с  этой целью при поверхностной  ферментации, достаточно 0,006-0,01% к массе мелассы, большая доза отрицательно действует на кислотообразующую способность А. пigег. Эффективен фурациллин в концентрации 10-15мг/л (добавляют при температуре 50⁰С ), 5-нитрофурилроданид и другие производные фурана.

Испытаны также муравьиная кислота, кремнефтористый натрий, пентахлорфенолят натрия, но они одновременно снижают выход лимонной кислоты. Сульфамидные препараты не подавляют бактерий. Бактерицидные концентрации антибиотиков (млн. ед./м³): стрептомицин 40, биомицин 4, тетрамицин 2, полимиксин 1. Известны рекомендации по применению неомицина, низина, левомицетина, полимиксина, а при вспышке дрожжевой инфекции – леворина. Однако, обладая эффективным антимикробным действием и отсутствием отрицательного влияния на А. niger, антибиотики имеют тот недостаток, что они очень дороги.

Тепловая стерилизация мелассных  сред при указанной выше температуре  снижает качество их для биохимической переработки. С целью «смягчения» теплового режима целесообразно тепловую обработку проводить в присутствии антимикробных веществ. Снижение температуры без существенного изменения состава питательной среды может быть достигнуто также предварительной обработкой ферментным препаратом, расщепляющим стенки бактерий и спор. Во всех случаях, когда требуется сохранить термолабильные компоненты среды, стерилизацию ведут при более высокой температуре и соответственно меньшем времени, так как с повышением температуры скорость гибели микроорганизмов возрастает быстрее скорости разрушения этих компонентов.

Предложено применение и других методов стерилизации мелассы: различными видами лучистой энергии (УФ-лучи, γ-лучи, лазерное излучение), ультразвуком, импульсными  электрическими разрядами, наложением электромагнитных полей сверхвысокой частоты, фильтрацией через антимикробные  волокна и т.д., но они пока не нашли  применения в производстве.

Культура Aspergillus niger – продуцент  лимонной кислоты

В настоящее время для ферментации  сахарсодержащих сред используют специальные  штаммы A. niger. Имеются патенты на применение других видов Aspergillus и других родов, принадлежащих к различным классам микроскопических грибов: A. wentii, A. lichinensis, A. clavatus, A. foetidus, A. awamori, A. carbonarius, A. glaucus, A. fumaricus, A. cinnamoneus, A. aureus, A. lanosus, A. melleus, A. ochraceus, A. gorakphurensis; Penicillium luteum, P. janthinellum, P. restricum, P. adamentzii, P. arenarium, P. olivaceum, P. divaricatum, P. sunguiflaus, P. glaucum; Mucor piriformis; Trichoderma viride; Botrytis sp.; Nematospora corily и др.

С производственной точки зрения A. niger и другие мицелиальные грибы  имеют существенные недостатки: медленно растут, вследствие чего процесс накопления необходимого количества биомассы продолжителен; большая вязкость культуральной жидкости, переходящая в неньютоновскую область, затрудняет массообмен, в частности снабжение гриба кислородом воздуха, увеличивает расход энергии на перемешивание. Перспективным является поиск и селекция немицелиальных микроорганизмов — дрожжей, бактерий, которые не имеют отмеченных недостатков. Это особенно желательно для перевода процесса ферментации на непрерывно-проточный.

 

 

Морфология Aspergillus niger

Aspergillus niger относится к классу  сумчатых грибов (Ascomycetes), семейству  аспергилловых (Aspergillaceae), роду Aspergillus, который в настоящее время насчитывает свыше 120 видов. Тело гриба (рис. 4) состоит из бесцветных, сильно разветвленных и переплетенных между собой тонких нитей — гиф, образующих мицелий (грибницу). Гифы септированы — разделены поперечными перегородками (септами) на клетки. Диаметр гиф от 3 до 6 мкм.

 
Рис 1. Aspergillus niger. 1 – гифы; 2 – конидиеносец; 3 – пузырек; 4 – стеригмы первого  ряда; 5 – стеригмы второго ряда; 6 – конидии; 7 – опорные клетки.

Для аспергиллов характерен поверхностный  стелющийся рост, однако при достаточной  аэрации и строгом соблюдении асептики они могут размножаться и в толще твердой и в  глубине жидкой среды.

При поверхностном росте возвышаются  органы плодоношения — конидиеносцы, которые отходят от особых опорных  клеток мицелия. Конидиеносцы представляют собой утолщенные неветвящиеся несептированные, сильно зернистые на вид гифы длиной до 2000 мкм и более. На концах конидиеносцев появляется перетяжка без перегородки, выделяющая «пузырек» будущей головки. Пузырек округляется, увеличивается до 400 мкм, на его поверхности вырастают радиально расположенные продолговатые одно- или двухрядные клетки — стеригмы. На свободных концах стеригм размещаются цепочками более мелкие клетки — конидии. Такое строение головки внешне похоже на наконечник лейки, из отверстий которого льются струйки воды. Отсюда русское название аспергилла — леечный гриб. Однако точный перевод термина аспергилл — «косматая голова».

Конидии — покоящиеся клетки, с  минимальным содержанием воды, шаровидной или элипсовидной формы, средним  размером в поперечнике 4 мкм. Поверхность  конидий — гладкая, бугристая  или шиповатая, черная (откуда и название этого гриба niger) или коричневая с различными оттенками. Окраска конидий определяет цвет всей конидиеносящей поверхности. Число конидий на каждой головке достигает 10 тысяч.

Зрелые конидии очень легко  отделяются от головок током воздуха  или струей воды. Попав в жидкую питательную среду, они сначала набухают, а затем прорастают, образуя одновременно один или два проростка (гифы), на твердой среде прорастают при наличии капельно-жидкой влаги, почти не набухая. Гифа растет на свободном конце; удлиняясь, дает боковые отростки, которые в свою очередь также удлиняются, ветвятся, переплетаются между собой, образуя колонии, видимые невооруженным глазом. Через 16—20 ч в центральной гифе начинают появляться обособленные клетки, из которых вырастают конидиеносцы. Образование зрелых конидий заканчивается через 3—4 суток.

Рассмотренный способ размножения A. niger называется бесполым. Вообще же аспергиллы могут размножаться и половым путем — посредством асков, образующихся в плодовых телах. Однако развитие плодовых тел A. niger прекращается на самой ранней стадии и недоразвитые плодовые тела превращаются в плотные скопления сплетенных гиф (склероции). Многие штаммы A. niger склероции не образуют. Гриб может размножаться и вегетативным путем — отделившиеся от гиф частицы способны самостоятельно расти и образовывать новый мицелий.

Условия жизнедеятельности Aspergillus niger

Жизнедеятельность A. niger проявляется  в процессах питания, дыхания, роста  и в реакциях на внешние раздражения. Питание и дыхание, необходимые организму для синтеза клеточного вещества и получения энергии, являются основой метаболизма (обмена веществ).

По типу питания аспергиллы относятся  к гетеротрофным организмам, усваивающим  углерод из органических соединений. Поступление в клетку растворенных в воде веществ происходит путем диффузии и осмоса через всю поверхность тела и регулируется цитоплазматической мембраной. Таким образом организм отбирает из окружающей среды необходимое питание.

Вследствие полупроницаемости  цитоплазматической мембраны через  нее свободно проникают в основном молекулы растворителя (воды). При этом главной движущей силой диффузии является разность концентраций веществ в окружающей среде и в цитоплазме клетки (перенос по градиенту концентрации) — пассивная диффузия. Большинство других веществ проходит через мембрану благодаря специальной системе переноса, находящейся в мембране и состоящей из белков-переносчиков и ферментов пермеазы, катализирующих связь субстрата с белком-переносчиком. При участии пермеаз осуществляется перенос одних веществ по градиенту концентрации— облегченная диффузия, других — против него—активный транспорт. В первом случае диффузия происходит без затраты энергии, во втором при переносе каждой молекулы субстрата затрачивается одна молекула АТФ (О.И.Колешко).

По сравнению с автотрофами  аспергиллы имеют клетки, проницаемые  для веществ большей молекулярной массы и обладающие высоким осмотическим давлением (осмотрофы). Питательная среда должна содержать все вещества или их фрагменты, которые не могут быть синтезированы клетками, но необходимы им для роста, размножения и снабжения энергией. Полноценное, сбалансированное питание, удовлетворяя эти потребности организма, не обеспечивает накопления в среде таких первичных метаболитов, как органические кислоты.

Таким образом, подобно всем живым  организмам, A. niger нуждается в обычных  органогенах — углероде, азоте, кислороде, водороде и многих других элементах.

Содержатся витамины (мкг/г): тиамин 150; рибофлавин 70—85; пантотеновая кислота 244—727; никотинамид 120—840; фолиевая кислота 210; цианкобаламин 178.

Существует мнение, что присутствие  витаминов в среде не обязательно, так как A. niger может синтезировать  их сам. Все же присутствие некоторых  из них в питательной среде  желательно. Так, биотин необходим для  нормального функционирования всех организмов. Он является простетической группой карбоксилаз.

Добавление небольших количеств  биотина в питательную среду  стимулирует рост A. niger. Аналогичное  действие оказывает добавление пантотеновой кислоты (простетической группы ацетил-КоА). Образование лимонной кислоты стимулируется тиамином.

 

 

 

 

 

Биохимическая схема и  система регуляции

Биосинтез лимонной кислоты  осуществляется с помощью культуры А. niger, специально селекционированной для получения высоких выходов  продукта. В качестве углеродсодержащего субстрата используют мелассу, которая кроме углеводов, содержит большой ряд органических кислот. Применение определенной питательной среды с сахарозой приводит к меньшему качественному разнообразию кислот (лимонная, щавелевая и глюконовая кислота).

Биохимический механизм образования  лимонной кислоты основан на функционировании цикла трикарбоновых кислот. Дегидрирование уксусной кислоты приводит к образованию  двух молекул СО₂ и четырех пар ионов водорода. В цикле происходит также образование НАДН и АТФ. Хотя большинство реакций цикла обратимы, основным направлением течения энзиматических реакций является образование щавелевоуксусной кислоты через α-кетоглутаровую, янтарную и фумаровую кислоты.

Реакцией, лимитирующей скорость оборота цикла, является синтез лимонной кислоты, катализируемый аллостерическим  ферментом цитратсинтетазой. Источником ацетил-КоА, который идет на синтез метаболитов цикла, является продукт  цикла – лимонная кислота –  легко переходящая в цитоплазму через мембрану. Как правило, из ЦТК  на нужды биосинтеза уходит значительное количество метаболитов, и пополнения их фонда и функционирования полного цикла в клетках существуют дополнительные возмещающие (анаплеротические) ферментативные механизмы, например глиоксилатный шунт. В последнем, в отличие от ЦТК, уксусная кислота расходуется на синтез. Следовательно, первой реакцией ЦТК является конденсация ацетил-КоА со щавелевоуксусной кислотой, катализируемая цитратсинтетазой. Именно активность этого фермента является контролирующим параметром, определяющим скорость метаболического потока в цикле. Ингибирующий эффект на цитратсинтетазу оказывает НАДН и сукцинил-КоА. Но основное влияние на скорость синтеза лимонной кислоты оказывает поступление субстрата (щавелевоуксусной кислоты). Так как непрерывная «работа» ЦТК требует реокисления восстановленных эквивалентов (используются 4 пары дегидрогеназ), максимальная скорость цикла наблюдается в условиях достаточного доступа кислорода в клеточную систему (т.е. при хорошей аэрации).

Аэрация имеет критическое  значение для глубиной ферментации. Пропускание чистого О₂ увеличивает образование лимонной кислоты, но это дорого; газовая фаза может циркулировать, если при этом поглощается СО₂. Прерывание аэрации на короткое время может иметь губительное действие на продукцию лимонной кислоты, но если при этом повысить рН с 3,0 до 4,0, то ферментация может начаться снова.

У грибов различают трофофазу, которая характеризуется ростом мицелия и активным дыханием с выделением СО₂, и идиофазу (продукционную фазу), когда рост завершен, дыхание подавлено, а оставшаяся глюкоза перерабатывается во вторичные метаболиты; в данном случае в лимонную или другие кислоты.

Образование лимонной кислоты  может быть условно разделено  на три процесса: 1 – разложение гексоз до пирувата и ацетил-КоА при гликолизе, 2 – анаплеротическое образование оксалоацетата из пирувата и СО₂ и 3 – аккумуляция цитрата в ЦТК. А. niger разлагает глюкозу по гексозодифосфатному (80%) и гексозомонофосфатному пути.

При работе первого пути СО₂,образованная в результате декарбоксилирования пирувата, фиксируется при анаплеротическом образовании оксалоацетата. (При работе гексозомонофосфатного пути СО2 не фиксируется). Наряду с гликолизом у A. niger частично реализуется и другой путь окисления углеводов — пентозофосфатный, называемый также пентозным, гексозомонофосфатным, или фосфоглюконатным. Общим с гликолизом исходным продуктом является глюкозо-6-фосфат, но в дальнейшем их пути расходятся: фермент фосфофруктокиназа определяет дихотомический путь, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа — апотомический. Конечными продуктами процесса являются 3-фосфоглицериновый альдегид и рибозо-5-фосфат. Первый из них по реакциям гликолиза превращается в пировиноградную кислоту, поэтому пентозофосфатный цикл рассматривается как шунт гликолитического пути. Основное назначение цикла — снабжение клетки НАДН₂, необходимой для восстановительных реакций синтеза липидов и стероидов, и пентозами, в основном рибозой, используемой в синтезе нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

Гексозомонофосфатный путь и гликолиз имеют много общих  ферментов. Таким образом, оба пути могут реализовываться в клетке одновременно. При превращении 6 молекул  глюкозо-6-фосфата по гексозомонофосфатному  пути суммарный эффект будет тот  же, что и при окислении 1 молекулы гексозы в СО2 по пути гликолиза  и ЦТК.

В процессе разложения глюкозы  образуются промежуточные соединения: манит, арабит, эритрит, глицерин.

 
Рис. 2 Биохимическая схема синтеза  лимонной кислоты

Образование лимонной кислоты  тесно связано со скоростью фиксации СО₂. Фиксацию СО₂ у А. niger осуществляет конститутивный фермент пируваткарбоксилаза. Существуют почти стехиометрическое отношение между фиксацией СО₂ и продукцией цитрата.