Культура клеток. Получение и применение первичной монослойной культуры

специального  датчика. Для борьбы с избыточным пенообразованием ис-

пользуется  механическое и химическое пеногашение. При механическом

пеногашении лопасти  пеногасителя размещаются на валу мешалки. При

химическом  пеногашении  в  крышке  сосуда  предусматривается  специ-

альный ввод для реагента гашения. Химические пеногасители более де-

шевы, их используют время от времени при необходимости  подавления

пенообразования. Однако при добавлении этих веществ может изменять-

ся состав питательной  среды. Пеногасящие вещества растительного (ку-

курузное, касторовое, соевое, подсолнечное масло, масло из семян хлоп-

чатника  и  другие)  и  животного (свиной,  говяжий,  бараний,  китовый  и

другие жиры) происхождения могут служить  микроорганизмам источни-

ком  углерода  и  энергии  и,  следовательно,  стимулировать  их  активное

развитие. Однако  известны  случаи,  когда природные  пеногасители  ока-

зывали  отрицательное  действие на метаболизм  клетки. А  такие немета-

болизируемые  пеногасители,  как  силиконы,  в  высокой  концентрации

токсичны. Поэтому  пеногасители, являющиеся поверхностно-активными 

веществами, следует  использовать только в очень низких концентрациях 

и  только  после тщательной  проверки.  Пеногасители  добавляют непо-

средственно в  среду перед стерилизацией или  в ферментер через специ-

альный ввод.

 

 

  3.2 Помещения для работы с культурами клеток

 

 

Стерилизация  питательных сред, как и все  другие манипуляции при работе с клеточными культурами, проводится в боксовых помещениях или в ламинар-боксах.

Боксовое помещение  представляет собой изолированную  комнату с несорбирующими пыль моющимися  покрытиями,  имеющую предбоксник  и обеспеченную необходимым общими специальным освещением, системами при точной и вытяжной вентиляции, холодными горячим водоснабжением, ат акже подводами газов и сжатого воздуха.

Альтернативой боксовым помещениям,  требующей  меньших затрат на оборудование,     являются ламинар-боксы,      или стерильные рабочие места. В этом случае в любом помещении может быть создан локальный стерильный объем,  необходимый для работы и создающий биологическую защиту пользователей.  Технически задача решается путем постоянного обдува места проведения работ ламинарным потоком. При работе с заведомо непатогенными материалами поток обеспыленного воздуха из рабочей зоны выходит непосредственно в окружающее пространство. В случае работы с потенциально патогенным материалом воздух перед выходом из рабочей зоны дополнительно фильтруется, возможность обдува оператора при этом исключена. В зависимости от устройства ламинар- бокса поток обеспыленного воздуха в рабочей зоне может быть горизонтальным, вертикальным или наклонным.

 

 

   3.3  Культуральная посуда

 

 

Основная часть ассортимента специальной культуральной посуды предназначена для роста клеток в монослое, что определяет особые требования к свойствам поверхности и материала изделий как из стекла, так и из пластика. Для культивирования клеток обычно используют  флаконы, колбы, матрасы, чашки Петри, платы, роллерные сосуды, пробирки, пипетки и т. д.

 

 

   3.3.1 Посуда из стекла

 

 

Хотя в последние годы широко применяется пластиковая посуда одноразового использования, посуда из стекла не утратила своего значения благодаря ряду бесспорных преимуществ:  хорошие адгезионные свойства поверхности,  способствующие прикреплению клеток;  многократность использования; биологическая инертность стекла ряда составов; термостойкость и другие. Кроме того, в экспериментах с контролируемым уровнем кислорода необходимо пользоваться именно стеклянной посудой,  т.  к.  в пластике кислород может растворяться.  Помимо этого из пластика могут экстрагироваться водорастворимые органические соединения.

Для стеклянной лабораторной и культуральной посуды на практике в основном применяются два типа составов –  многощелочное и малощелочное боросиликатное стекло типа «Пирекс».

Существует также группа макропористых стекол, которые не используются для изготовления посуды, но применяются при культивировании клеток в качестве микроносителей.

Однако успех в эксперименте обеспечивается не только качеством стекла,  но и степенью подготовки лабораторной посуды.  Посуда для культивирования должна быть чистой физически,  химически и бактериологически.

 

   3.3.2 Пластиковая посуда

 

 

Начиная с 1965 г. все большее применение в лабораторной практике находит пластиковая посуда одноразового использования. При работе с культурами клеток пластиковая посуда в отдельных случаях более пригодна из-за характерных особенностей некоторых клеточных линий. Такая посуда проста в использовании, т. к. выпускается в стерильном, готовом к работе виде.

Пластиковая посуда производится в двух модификациях: для культивирования микроорганизмов и для культивирования клеток. Такое разделение вызвано тем, что культивируемые клетки (речь идет о монослойном культивировании) в отличие от бактериальных клеток находятся в непосредственном контакте с поверхностью сосуда,  которая является для них субстратом. Клетки оседают на этой поверхности, прикрепляются и распластываются.  Для улучшения адгезионных свойств поверхности из полистирола ее подвергают специальной обработке, в то время как биологическая посуда не обрабатывается.

Таким образом, одним из первых условий успешного культивирования клеток является хороший субстрат,  т. е.  посуда,       обеспечивающая максимальную адгезию, распластывание и, следовательно, рост.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

 

Клеточные культуры с каждым годом находят все  большее применение в самых разнообразных  областях биологии,  медицины и сельского хозяйства. Их используют при решении таких общебиологических проблем, как выяснение механизмов дифференцировки и пролиферации, взаимодействия клеток со средой, адаптации, старения, биологической подвижности, злокачественной трансформации многих других.

Важная роль отводится клеточным культурам  в биотехнологии при производстве вакцин и биологически активных веществ. Они являются исходным материалом для  создания клеток-продуцентов, используются в целях повышения продуктивности сельскохозяйственных животных и для выведения новых сортов растений.  Культуры клеток применяются для  диагностики и лечения наследственных заболеваний, в качестве тест- объектов при испытании новых фармакологических веществ, а также для сохранения генофонда исчезающих видов животных и растений.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

 

1.О.В.Блажевич,курс лекций «Культивирование клеток» - Минск: БГУ,2004.-78с.

2.Адамс Р. «Метод культуры клеток для биохимиков». - М.: Мир, 1983 –

263 с.

3.Культура животных клеток. Методы. / Под ред. Р. Фрешни. - М.: Мир,  1989, - 333 с.

4.Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.:

Мир, 1978. - 333 с.