Культура клеток. Получение и применение первичной монослойной культуры

 

 

 

 

   1.1.2 Типы культуральных систем

 

   1.1.1.1 Непроточные культуры.

 Обычный тип культур,  в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. Эти системы пригодны для культивирования клеток как в монослое, так и в суспензии. По мере роста клеток в среде культивирования происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов – следовательно, среда должна постоянно меняться, что, в свою очередь, приводит к изменению клеточно гометаболизма (физиологической дифференцировке). Системы непроточных культур характеризуются в той или иной степени накоплением отходов и непостоянством внешних условий.

   Способы увеличения  продолжительности жизни культур:

а)  прерывистый – часть  культуры заменяется равным объемом  свежей среды;

б) постоянный – объем  культуры постоянно увеличивается  с низкой скоростью, а небольшие  порции клеток периодически удаляются;

в) перфузионный – постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного  объема использованной бесклеточной среды.

 

     1.1.1.2 Проточные культуры. 

Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия  без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Это единственная система, в которой все клетки гомогенны и сохраняют гомогенность в течение длительного периода, что имеет очень важное значение в физиологических исследованиях. Однако использование таких культур для получения клеточных продуктов не выгодно с экономической точки зрения. Системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

 

 

   1.2 Культуральные системы животных клеток

 

 

Различают 3  основных типа культур животных клеток: первичные культуры, получаемые практически из любого органа и существующие лишь до первого пересева; диплоидные культуры, чаще получаемые из эмбриональных тканей и сохраняющие диплоидный набор хромосом до 50 пересевов, которые затем трансформируются в постоянные (перевиваемые)  гетероплоидные культуры,  существующие вне организма десятки лет.

Кроме того,  культуры тканей могут подразделяться по виду животного,  от которого они происходят;  по типу ткани- источника; по состоянию ткани на момент извлечения (нормальные,  опухолевые), по способу выращивания (монослойные,  суспензионные,  на микроносителях и т. п.).

Главным фактором при выборе ткани или линии клеток для дальнейшего исследования является природа процесса, который будет изучаться на этих клетках.

Как правило, культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с культурами из соответствующих взрослых тканей, но несмотря на ряд практических преимуществ, необходимо помнить, что эти клетки по некоторым параметрам отличаются от взрослых клеток.

Нормальные ткани,  как правило,  дают начало культурам с ограниченным временем жизни,  тогда как культуры клеток, полученные из опухолей, способны пролиферировать неограниченно долгое время.

 

 

   1.2.1 Первичные клетки

 

Термином «первичная»  обозначают клеточную культуру, полученную непосредственно из тканей человека или животных в эмбриональном или постнатальном периоде. Срок жизни таких  культур ограничен. По прошествии определенного времени в них возникают явления  неспецифической дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации  цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались. Периодическая смена среды, изменение  состава последней  и другие процедуры могут лишь несколько  увеличить сроки жизни первичной клеточной культуры, но не  могут  предотвратить ее конечной деструкции и гибели. По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием метаболической  активности  клеток, выведенных из-под контроля   нейрогуморальных факторов, действующих в целостном организме. Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фоне  дегенерации большей части клеточного пласта могут сохранить способность к росту и размножению. Эти клетки, обнаружив потенцию  бесконечного размножения  in vitro,  при многократных  перевивках  дают  начало  перевиваемым  культурам клеток.

Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по сравнению  с  любой первичной культурой, состоит  в  потенции  неограниченного  размножения  вне организма  и  относительной  автономности  сближающей  их с бактериями и одноклеточными простейшими. Способность перевиваемых клеток к бесконечному  размножению  in  vitro знаменует собой качественный  скачок, в результате которого клетки приобретают способность к автономному существованию, подобно микроорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах.

 

 

   1.2.2 Постоянные культуры

 

После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет (ограниченная линия клеток), либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией. Различия в свойствах этих клеток и большой период времени, предшествующий их появлению (иногда несколько месяцев), позволяет предположить мутационную природу появления клеток постоянной культуры (стволовые клетки). Нельзя исключить и возможность существования «бессмертных» клеток, особенно в культурах,  полученных из опухолей. Появление постоянной линии клеток констатируется по морфологическим изменениям (уменьшение размера клеток, снижение их адгезивности, округление, увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения), по увеличению скорости роста (время удвоения клеток снижается в 1,5-3 раза), по снижению зависимости от сыворотки и возможности поддержания в более простых средах, по снижению зависимости от субстрата и, следовательно, их способности к росту в суспензии; по увеличению гетероплоидности и анеуплоидности, а также по увеличению опухолеродности. Однако нормальные клетки, спонтанно трансформируясь в постоянную линию, не становятся при этом злокачественными (несмотря на некоторые черты сходства). Таким образом, постоянные клеточные линии имеют определенные преимущества: высокая скорость роста, возможность достижения более высокой плотностии, следовательно, более высокого выхода биомассы; возможность использования более дешевых сред; способность к суспензионному росту. Но также они имеют и недостатки –  повышенная хромосомная нестабильность,  отклонение от фенотипадонора, утрата специфических маркеров. Необходимо отметить, что в литературе имеются разногласия по поводу употребления терминов «линия клеток» и «штамм клеток», в связи с чем многие авторы рассматривают их как взаимозаменяемые. Другие исследователи определяют штамм клеток как популяцию клеток, полученную из первичной культуры путем пересева, а под линией клеток понимают клеточную популяцию, полученную из первичной культуры и выращиваемую неопределенно долгоевремя in vitro.

 

   1.2.3  Монослойные перевиваемые культуры клеток

 

Большинство нетрансформированных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату: к другим клеткам либо к стеклу (алюмоборосиликатное стекло,   чащемодифицированное), пластику (полистирол, полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целлофан и другие при условии правильной обработки этих полимеров – пластиковая поверхность должна быть специально обработана, чтобы клетки могли к ней прикрепиться, причем клетки эукариот не прикрепляются к пластиковым чашкам, предназначенным для бактериальных культур) или металлу (качественная нержавеющая сталь или титан). Поверхности клеток животных и поверхности традиционных культуральных сосудов из стекла и пластика, обладающие высокой поверхностной энергией, несут отрицательные заряды. Поэтому для прикрепления клеток необходимо образование поперечных сшивок с гликопротеинами (наиболее изученным является фибронектин,  присутствующий в сыворотке и других физиологических жидкостях), а также присутствие двух-валентных катионов кальция и магния. Суммарный отрицательный заряд поверхности субстрата (например, за счет образования отрицательно заряженных карбоксильныхг рупп) может достигаться предварительным воздействием химическими (окисляющие агенты) и физическими факторами (высоковольтный разряд, облучение УФ), что облегчает электростатическое прикрепление клеток. Поверхность культурального сосуда может быть также покрыта веществом, облегчающим прикрепление клеток. К природным субстратам, на которых растут клетки, относятся коллаген и желатин. Для этих целей используют коммерческие препараты коллагена для культуры тканей (например, «Витроген 100»), что позволяет избежать утомительной процедуры получения коллагена из крысиных хвостов.

Монослойные культуры имеют ряд преимуществ, являющихся предпосылками их широкого использования:

1) выделение  секретируемого продукта многими  клетками осуществляется эффективнее  в случае их прикрепления к  субстрату;

2) возможность  быстрой и легкой замены питательной среды, сопоставления времени и количества среды с периодом роста клеток или временем наработки продукта;

3) обеспечение  наибольшей гибкости исследований, поскольку в монослой могут  быть введены любые типы клеток;

4) достижение  искусственно высокой плотности  клеток с использованием перфузионной  техники;

5) возможность использования одной и той же аппаратуры с разным отношением клетки- среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.

Однако при  использовании монослойных культур  выявляются и недостатки:

1) сложность  масштабирования;

2) отсутствие  информативности визуального анализа;

3) трудности  с определением и поддержанием  таких параметров, как

Кислотность и  содержаниеО2, и обеспечением гомогенности культуры

клеток;

4) необходимость  значительных пространств.

 

 

   1.3  Питательные среды

 

 

Оптимизация состава  питательных сред для культур животных клеток развивалась в двух направлениях – разработка сред, требующих внесения природных добавок (сыворотки, эмбриональныеэкстрактыидр.), и создание сред химически определенного состава.

В настоящее время наиболее широко применяются среды,  содержащие источники энергии (углеводы) и азота; незаменимые аминокислоты; витамины; неорганические соли –источники макро- и микроэлементов, включая селенит;  нуклеозиды;  жиры и жирорастворимые компоненты; гормоны (инсулин, трансферрин, глюкокортикоиды, эстроген, андроген, тироксин,  трииодтиронин);ростовые факторы (фактор роста,  синтезируемый тромбоцитами,  фактор роста фибробластов,  фактор роста эпидермиса), а также сыворотку (до 10 %) и в ряде случаев некоторые другие добавки (бактопептон, триптозофосфат и т. п.).

В 40-50-егг. прошлого века большая часть клеток выращивалась в плазме или на фибриногеновом сгустке в присутствии тканевых экстрактов или их ультрафильтратов. Начиная со среды  199, предложенной Г. Моргоном в 1950 г. и содержащей более 60 синтетических ингредиентов,  широко осуществляется подбор состава и методов приготовления различных питательных сред.  В своей классической работе в 1955г. Х.Игл исследовал потребности клеточных линий мышей L и HeLa в питательных веществах. Это злокачественные клетки, характеризующиеся различным кариотипом и сходные по своей морфологии с клетками плоского эпителия. Х.Игл использовал среды определенного состава, содержащие смесь аминокислот, витаминов, солей и углеводов, а также небольшое количество диализированной сыворотки лошади или человека. Сыворотка в их составе служит источником не идентифицированных факторов.

Питательные среды  — субстраты, состоящие из компонентов, обеспечивающих необходимые условия  для культивирования микроорганизмов  или накопления продуктов их жизнедеятельности.

Питательные среды  различаются по назначению, консистенции и составу. По назначению их условно  подразделяют на две основные группы — диагностические и производственные среды. Диагностические П. с. включают пять подгрупп: среды для выращивания широкого спектра микроорганизмов; среды для выделения конкретного возбудителя; дифференциальные среды, позволяющие различать отдельные виды микроорганизмов; среды для идентификации микроорганизмов и накопительные среды, предназначенные для обогащения конкретного вида микроорганизмов. К числу производственных относятся П. с., используемые при промышленном изготовлении медицинских биологических препаратов (бактериальных вакцин, анатоксинов и др.) и контроле их качества. П. с. для производства бактерийных препаратов в отличие от диагностических сред не должны содержать вредных для человека примесей и оказывать отрицательного влияния на процесс производства (не препятствуя, в частности, удалению из изготавливаемых препаратов продуктов микробного метаболизма, балластных органических и минеральных веществ).

По консистенции различают  жидкие, плотные и полужидкие среды. Плотные и полужидкие П. с. готовят  из жидких посредством прибавления  к ним агара или (реже) желатина. Агар-агар — полисахарид, получаемый из определенных сортов морских водорослей. Агар обычно вносят в П. с. в концентрации 1—2% (при изготовлении полужидких сред — 0,2—0,4%), желатин — 10—15%. При t° 25—30° желатиновые среды плавятся, поэтому микроорганизмы на них выращивают преимущественно при комнатной температуре. В качестве плотных сред применяют также свернутую сыворотку крови, свернутые яйца, картофель и среды, содержащие 1,5% силикагеля.

По составу П. с. делят  на простые и сложные. Простые  П. с. обеспечивают питательные потребности большинства патогенных микроорганизмов (мясопептонный бульон, мясопептонный агар, бульон и агар Хоттингера, питательный желатин, пептонная вода и др.). К сложным относят специальные среды для микробов, которые не растут на простых П. с. Такие среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма. Сложными П. с. являются и дифференциально-диагностические среды, например среды Гисса с углеводами и индикатором, применяемые для определения видовой принадлежности исследуемого микроба по его ферментативной активности. Некоторые сложные среды, так называемые селективные, или элективные, используют для целенаправленного выделения одного или нескольких видов микроорганизмов путем создания оптимальных условий их выращивания и угнетения роста сопутствующей микрофлоры. Например, висмут-сульфитный агар — строго селективная среда для выделения сальмонелл, агар и среда Левина — слабоселективные среды для выделения энтеробактерий.

В зависимости от состава  исходных компонентов различают  также среды синтетические, полусинтетические  и природного происхождения. Синтетические  среды, составные части которых  точно известны, и несколько в  меньшей степени полусинтетические  удобны и используются главным образом для изучения физиологических процессов микроорганизмов. Применение сред такого типа позволяет определить минимальные потребности отдельных микроорганизмов в питательных веществах и, исходя из этого, создать П. с., содержащие лишь те соединения, которые необходимы для роста данного микроба. Преимуществом синтетических П. с. является также их стандартность, однако использование этих сред ограничено из-за высокой стоимости и сложности состава многих из них (нередко они содержат до 40 и более ингредиентов). К тому же они более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми компонентами П. с., особенно аминокислотами, и размножение микроорганизмов на таких средах легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами.