Культура клеток. Получение и применение первичной монослойной культуры

Министерство  образования Республики Беларусь                                      Учреждения образования «Гродненский государственный университет                                        имени Янки Купалы»

 

Факультета  биологии и экологии

Кафедра биохимии

 

Курсовая работа

 

 

КУЛЬТУРА КЛЕТОК. ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ МОНОСЛОЙНОЙ КУЛЬТУРЫ.

 

 

                                                                

 

 

                                                                          Исполнитель:     

                                                                         студентка 3 курса

                                                                         специальности Биология 1-310101

                                                                        (Биотехнология 1-310101-03)

                                                                         Драгун Елена Леонидовна

 

                                                                        Научный руководитель:

                                                                         старший преподаватель кафедры

                                                                         химии и химической технологии

                                                                         Бурдь Галина Алексеевна

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Гродно 2010 
ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ  …………………………………………………………………………………….3                                                                                                                             

      ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ                                             6 

 

                  1.1    Культура клеток как метод исследования  ……………………………....6

                           1.1.1    Типы культуральных систем……………………………………….....8

                           1.1.2   Непроточные культуры ……………………….....................................8

                1.2    Культуральные системы животных клеток ……………………………..8

                          1.2.1 Первичная культура ……………………………………………………..9

                          1.2.2 Постоянные культуры…………………………………………………..10

                          1.2.3 Монослойные перевиваемые культуры клеток……………………….11

                 1.3    Питательные среды………………………………………………………....12

 

     ГЛАВА 2.ОПИСАНИЕ ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ .................19

 

                 2.1    Приготовление первичных  клеточных культур…………………...…...19

                 2.2    Получение монослойных перевиваемых культур клеток……...………20

                         2.2.1 Требования к поверхности субстрата……………………………….....20

                          2.2.2 Монослойное культивирование на микроносителях………….……...23

 

      ГЛАВА  3. ТЕХНИЧЕСКОЕ ОСНОЩЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТА  С 

                         КЛЕТОЧНЫМИ КУЛЬТУРАМИ …………………………………………24

 

                  3.1    Оборудование культуральных лабораторий ……………………….…...24                                    

                          3.1.1    Лабораторные термостаты……………………………………………24

                          3.1.2    СО2-инкубаторы………………………………………………………24

                          3.1.3   Аэратор ………………………………………………………………..25

                          3.1.4    Лабораторные встряхиватели………………………………………...25

                  3.2    Помещения для работы с культурами клеток ………………………….27

                 3.3    Культуральная посуда……………………………………………………...28

                          3.3.1    Посуда из стекла……………………………………………………...28

                           3.3.2    Пластиковая посуда…………………………………………………..29

ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………….............................30

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК …………………………………………………….31

 

ВВДЕНИЕ

 

 

Первые попытки  культивирования клеток животных вне  организма относятся к концу  прошлого столетия. Эти  отрывочные наблюдения указывали на возможность  сохранения жизнеспособности тканей и клеток в  искусственных условиях и положили начало глубоким научным исследованиям тканевых культур. Большая заслуга в деле paзработки методов культивирования тканей принадлежит Каррелю. Первые опыты по культуре животных тканей были проведены немецким биологом  В. Ру, которому удалось в 1885  г. в течение нескольких дней поддерживать развитие нервной пластинки куриного эмбриона в теплом солевом растворе.      Однако лишь предложенная американским биологом Р. Гаррисоном в 1907  г. воспроизводимая техника послужила основой для дальнейшего развития метода культивирования животных клеток вне организма.

Культивирование клеток и тканей животных к настоящему времени получило широкое распространение  в различных областях исследований от клеточной и молекулярной биологии до быстро прогрессирующих прикладных областей биотехнологии. Культуру животных тканей применяют для изучения механизмов роста и дифференцировки клеток, гистогенеза, межтканевых и межклеточных взаимодействий, обмена веществ и т. п. Культуры животных клеток являются важными продуцентами многих биологически важных веществ. На них выращивают вирусы для их идентификации и получения вакцин. Клеточные культуры часто применяют при тестировании и изучении механизма действия лекарственных и косметических средств, пестицидов, консервантов и т. п. Методы культуры клеток нашли широкое применение для реконструкции различных тканей и органов. Так, культура клеток кожи исспользуется для  заместительной терапии при ожогах,  культура клеток эндотелия для реконструкции стенок сосудов. Способность клеток к росту в культуре привела к развитию методов клонирования, хранения и слияния клеток, что, в свою очередь, вызвало становление новой области науки-генетики соматических клеток. Органные культуры используют при изучении закономерностей развития органов,  для изучения способов сохранения жизнеспособности изолированных органов, предназначенных для трансплантации. В настоящее время практически любые клетки человека и животных могут быть введены в культуру и тем самым служить средством и объектом во многих медико-биологических исследованиях.  Одно из важнейших преимуществ клеток в культуре - возможность прижизненного наблюдения за ними с помощью микроскопа. Немаловажно и то, что культуры клеток в ряде случаев могут быть равноценной заменой клинических экспериментов, для которых потребовалось бы участие добровольцев. Эксперименты, требующие для выяснения того или иного вопроса использования 1000 человек, могут быть с равной статистической достоверностью поставлены на 100 культурах на покровных стёклах.

Благодаря культивированию  клеток возможности исследования и  диагностики расширяются почти  беспредельно, так как имеется  возможность оценки не только морфологических  и биохимических изменений, но и  изменений в поведении клеток, их реакции на различные агенты, в том числе и на лекарственные воздействия. Поскольку клетки в культуре легко доступны для различных биохимических манипуляций, то при работе с ними радиоактивные предшественники, яды, гормоны и другие агенты могут быть введены в заданной концентрации и в течение заданного периода.  Исчезает  опасность того, что исследуемое соединение метаболизируется печенью, запасается мышцами или экскретируется почками. При использовании клеточных культур, как правило, легко установить время контакта исследуемого вещества с клетками, изменение его концентрации в течение данного периода времени. Это обеспечивает получение реальных значений скорости включения или метаболизма исследуемых соединений.

Клеточные линии  применяют для тестирования и  изучения механизма действия различных веществ, которые могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов, детергентов, косметических средств, инсектицидов, консервантов. Результаты, полученные на клеточных культурах, нельзя экстраполировать на целый организм, но если изучаемое вещество оказывает повреждающее действие в нескольких линиях культивируемых клеток, то следует ожидать от неблагоприятного эффекта и на организм человека.

Кроме того, если в ряду поколений воспроизводится  дефект, свойственный клеткам in vivo, значит это дефект наследственный. Благодаря возможностям генной инженерии изменение генотипа клеток стало реальностью. Мы можем выделить из организма мутантые клетки, заменить in vitro дефектные гены, получить линию здоровых генно - модифицированных клеток и ввести их опять в организм.

   Наиболее  часто культивируются следующие  элементы: соединительной ткани – фибробласты; скелетной – кость и хрящи; мышечной – скелетные, сердечные и гладкие мышцы; эпителиальной – печень, легкие, кожа, мочевой пузырь, почки, молочная железа; нервной – глиальные клетки и нейроны (хотя они лишены способности к пролиферации);эндокринной системы – гипофиз, надпочечники, клетки островков  Лангерганса; различные типы опухолевых клеток.

 Целью данной курсовой работы является изучение и анализ культуры клеток на производственной практике в ГНЦ НПЦ «Институте фармокологии и биохимии НАНБ».

  В процессе выполнения данной курсовой работы будут решаться задачи:

1. Дать характеристику культуре клеток как методу исследования.

2. Анализ методов  получения первичной монослойной  культуры.

3. Анализ применения  культуры клеток в научных  исследованиях и в промышленности.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ГЛАВА 1

АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР  ЛИТЕРАТУРЫ

 

 

   1.1 Культура клеток как метод исследования

 

 

Перенесение клеток целостного  организма в условия жизни  in vitro элементов ткани или органа, в состав которых они ранее входили. При этом клетки выходят из-под контроля нейро-гуморальных факторов и приобретают ряд особенностей, зависящих как от самого  факта отторжения клеток от этих тканей, так и от конкретных условий их существования in vitro.

   Живущие вне организма  клетки  или ткани характеризуются  целым комплексом метаболических, морфологических и генетических черт, резко отличных от свойств клеток органов и тканей in vivo. В зависимости от методики первичной эксплантации ткани и техники  ее культивирования различают несколько видов переживающих и растущих культур тканей и клеток.  Наибольшее  распространение имеют  однослойные, а также суспензионные  культуры  растущих  клеток. Именно они составляют основу современной лабораторной и производственной вирусологической практики. Различают два основных вида однослойных клеточных культур: первичные и перевиваемые.

Термином «первичная»  обозначают клеточную культуру, полученную непосредственно из  тканей человека или животных в эмбриональном  или постнатальном периоде. Срок жизни таких  культур ограничен. По прошествии определенного времени  в них возникают явления  неспецифической дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации  цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались. Периодическая смена среды, изменение  состава последней  и другие процедуры могут лишь несколько увеличить сроки жизни первичной клеточной культуры, но не  могут предотвратить ее конечной деструкции и гибели. По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием метаболической  активности  клеток, выведенных из-под контроля   нейрогуморальных факторов, действующих в целостном организме. Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фоне  дегенерации большей части клеточного пласта могут сохранить способность к росту и размножению. Эти клетки, обнаружив потенцию  бесконечного размножения  in vitro,  при многократных  перевивках  дают  начало  перевиваемым  культурам клеток.

Различают  линии  и штаммы  перевиваемых клеток. Первым термином обозначают перевиваемые клетки, характеризующиеся потенциальным  бессмертием и, как правило, гетероплоидным кариотипом вторым термином — полуперевиваемые  клетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни in vitro. Появление и тех, и других клеток  связано с процессом отбора в клеточной популяции первичных культур,  являющихся, таким образом, источником всех линий и штаммов перевиваемых клеток.

Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по сравнению  с  любой первичной культурой, состоит  в  потенции  неограниченного  размножения  вне организма  и  относительной  автономности  сближающей  их с бактериями и одноклеточными простейшими. Способность перевиваемых клеток к бесконечному  размножению  in  vitro знаменует собой качественный  скачок, в результате которого клетки приобретают способность к автономному существованию, подобно микроорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах. Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей, называют  трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными. Усовершенствование техники культивирования клеток значительно расширило возможности  получения  перевиваемых клеточных  линий из самых разнообразных тканей  животных и человека. При этом не был  обнаружен возрастной предел, выше которого ткани утрачивали бы  способность  адаптации к неограниченному росту in vitro, т.е. к трансформации. Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo в результате развития патологического процесса, этиология которого во многом остается еще невыясненной. Не все злокачественные новообразования способны давать начало перевиваемым клеточным культурам. Так, например, безуспешными были попытки получить перевиваемые клетки из раковых опухолей желудка и молочных желез человека. С  трудом удается адаптировать к жизни in vitro клетки плоскоклеточного рака кожи и слизистых. С другой стороны, сравнительно легко выводятся линии из тканей сарком и злокачественных опухолей нервной системы. Особую категорию клеточных культур составляют полуперевиваемые штаммы, имеющие диплоидный набор хромосом. Они выгодно сочетают в себе черты первичных и перевиваемых клеток.