Культура клеток. Получение и применение первичной монослойной культуры

Как уже отмечалось  выше, одним из методов получения  перевиваемых клеточных линий является отбор клеток с повышенной активностью  роста и размножения из популяции  первичных культур. Отбор  можно  осуществить  при регулярной  смене  среды,  омывающей монослой  первично  трипсинизированной клеточной культуры. Для  этого  отбирают матрасы с хорошо сформированным клеточным монослоем (сами матрасы должны иметь ровное дно и не должны иметь на стенках царапин и  матовых  пятен). Приготовленную для систематической смены ростовую среду разливают по небольшим сосудам  (чтобы  исключить бактериальное загрязнение) и хранят при t - 4°. Смену среды производят регулярно, не реже 1 раза в неделю. В течениепервых 3 недель заменяют по 20 - 30% объема ростовой среды, в течениеследующих 3 - 4 недель - 50 - 60%, позднее проводят полную смену среды. Свежую среду непосредственно перед работой подогревают до t - 37°.

По мере смены  сред клетки меняют свою морфологию. Часть  клеток округляется и отпадает от стекла. Большинство клеток стягивается  к  центру,и монослой приобретает  звездчатый  вид.  Сами  клетки  при  этом  несколько удлиняются. Через 7 - 10  смен  среды в матрасах, как  правило, начинают появляться новые клеточные элементы, причем в разных культурах они имеют разную морфологию. В культуре клеток почки куриного эмбриона в центре монослоя или  между стянутыми его участками появляются  округленные клеточные  элементы, из которых постепенно формируются скопления в виде небольших колоний. В культуре клеток почки обезьяны появляются одиночные образования, напоминающие зерна. Клетки плотно прилегают друг  к другу, образуя мелкие прозрачные колонии. Количество  таких клеток  нарастает медленно,  размеры колоний также почти не увеличиваются. Колонии появляются не только  на  дне матраса, но также на боковых поверхностях,  на  границе питательной среды.

Поэтому  обязательным  условием  при  смене   питательной   среды   является поддержание  ее  постоянного  объема.  В  культуре  клеток  почек   эмбриона человека на фоне массовой дегенерации стянутого в тяжи  монослоя  выявляются крупные полигональные клетки с длинными отростками.

Возникшие в  процессе отбора атипичные клеточные  элементы  должны  быть отделены от остальных участков монослоя и  перенесены  в  отдельные  пробирки или матрасы.  Для  этого  может  быть  использован  метод  версенизации  или механический откол атипичных клеток с помощью бактериологической  петли  или шпателя. Последний способ особенно необходим при работе с  культурой  клеток почек обезьяны, где колонии атипичных клеток плотно прикреплены к  стеклу  и сами от него не отделяются.

При смене  питательной  среды  в  случае  появления  атипичных  клеток рекомендуется  осторожно удалить большую часть  ростовой среды, а меньшей частью энергично отполоскать монослой и эту среду разлить  по  пробиркам.  В этом случае в среде могут оказаться атипичные клетки, обладающие способностью образовывать колонии, пригодные для дальнейших пересевов.

После переноса культуры атипичных клеток в новую  посуду наблюдение  за основной культурой  целесообразно продолжить,  так  как  процесс  выведения новой  клеточной  линии  весьма  сложен, и  далеко не  всегда   отобранные атипичные элементы дают начало  жизнеспособной  линии  перевиваемых  клеток. Необходимо,  чтобы  вся  работа  по   получению   новых   клеточных   линий, продолжающаяся в течение многих месяцев, проводилась  с  одними  и  теми  же питательными средами, сыворотками животных и сериями антибиотиков. Известны  такие  первичные  культуры,  как   культура  клеток   почки золотистого хомячка (BHK),  культура  клеток  почки   сибирского   горного козерога (ПСГК), культура клеток почки зеленой мартышки (CV).

 

 

   2.2.2 Монослойное культивирование на микроносителях

 

Сочетать положительные  стороны монослойного и суспензионного культивирования позволяет использование системы с микроносителями.

Микроносители – мелкие твердые частицы (поддерживаемые в суспензии благодаря перемешиванию), на поверхности которых клетки растут в виде монослоя. Использование микроносителей дает клеткам, обладающим адгезивными свойствами, все преимущества крупномасштабных суспензионных культур. Микроносители должны быть нетоксичными, несорбировать компоненты питательных сред и продукты метаболизма клеток, а также иметь поверхностный заряд или обменную емкость, достаточную для прикрепления клеток.

Коммерческие  микроносители имеют диаметр 100-200 мкм и подразделяютсяна 6 основныхгрупп:

    1) декстрановые  микроносители, поперечносшитые,  типа Cytodex 1;

    2) декстрановые  микроносителитипа Cytodex 2;

    3) микроносители,  покрытые коллагеном или желатином,  типа Cytodex 3;

    4) полистиреновые  микроносители типа Biosilon, Cytospheres;

    5) стеклянные  микроносители типа Bioglass;

    6) целлюлозные  микроносители типаДЕ-53.

Используемые в настоящее время микроносители на основе микропористого желатина или пористого боросиликатного стекла имеют емкость около 3000 клеток/микроноситель.

 

ГЛАВА 3

ТЕХНИЧЕСКОЕ ОСНАЩЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТА С КЛЕТОЧНЫМИ КУЛЬТУРАМИ

 

 

   3.1 Оборудование культуральных лабораторий

 

 

   3.1.1 Лабораторные термостаты

 

 

Лабораторные термостаты для культивирования клеток должны отвечать ряду специальных требований:   1) обеспечивать высокую стабильность поддержания заданной температуры;   2)  создавать минимальный градиент температуры по полезному объему; 3) обладать системой быстрого восстановления температуры после кратковременного открывания полезного объема; 4) внутренний объем должен изготавливаться из биологически пассивных материалов,  т.  е.  невлияющих на жизнедеятельность клеток и стойких к воздействию компонентов питательных сред.

По своей конструкции лабораторные термостаты подразделяются на жидкостные и воздушные. В жидкостных термостатах полезный объем окружен емкостью, наполненной дистиллированной водой, которую собственно и нагревают.  Воздушные термостаты имеют полезный объем, непосредственно контактирующий с электронагревательными элементами.

 

 

   3.1.2 СО2-инкубаторы

 

 

Необходимость поддержания постоянной величины рН в питательной среде и ее минимального  испарения в период инкубации клеток привела к разработке специальных приборов, аналогичных описанным выше термостатам.Главным отличием является наличие систем создания и поддержания определенного состава газовой среды в полезном объеме и высокой относительной влажности в нем.  Это так называемые углекислотные инкубаторы,       выпускаемые фирмами  «Heraues», «Hotpack», «Flow».

Газовая среда в камерах СО2-инкубатора содержит повышенную концентрацию кислорода и углекислого газа, а в большинстве случаев только углекислого газа.

   3.1.3 Аэраторы

 

 

Для обеспечения аэрации культуральной среды –  снабжения кислородом-используют воздух, а также воздух, обогащенный кислородом,реже-чистый кислород. Процессы, протекающие без доступа кислорода (анаэробные), зависят от газообразных субстратов ит ребуют отвода газообразных продуктов жизнедеятельности. Аэраторы – основной пример функционирующих систем газоснабжения и газоотвода.

 

 

   3.1.4 Лабораторные встряхиватели

 

 

Большое  значение  в  оснащении  лаборатории,  предназначенной  для 

культивирования  клеток,  имеют  приборы,  обеспечивающие  принуди-

тельное перемешивание  питательных сред с помещенными  в них клеточ-

ными культурами, обеспечивая лучший газообмен и  тем самым повышая 

эффективность  культивирования.  Большинство моделей  встряхивателей

позволяет перемешивание в одном режиме – вращательном или возврат-

но-поступательном.  Хотя  наиболее  современные  модели (фирма 

«Infors») являются универсальными, т. е. работают в разных режимах пе-

ремешивания. Роллерные  установки – аппараты, позволяющие  успешно

применять  один  из  общепринятых  методов  культивирования  клеток – 

выращивание их в цилиндрических сосудах из боросиликатного  стекла с 

небольшим  количеством  питательной  среды,  вращающихся  в  горизон-

тальном положении  со скоростью 8 оборотов/мин, обеспечивая постоян-

ное перемешивание  питательной среды и интенсивный  рост клеток. Для 

повышения  эффективности  массового культивирования установки  обес-

печены  системой,  дающей  возможность  заменять  питательную  среду  и 

удалять супернатант без остановки вращения. Для этого сосуды снабжа-

ются  специальными  перфузионными  пробками,  в  которых  центральная 

часть  вращается  независимо  от периферийной. В  эту  часть пробки  вво-

дятся  трубки  для  смены  питательной  среды,  удаления  супернатанта  и

введения инокулята. В  состав данной  системы  также  входят перисталь-

тические насосы и блок автоматики, регулирующий их работу.

Лабораторные  ферментеры

Это комплексы  приборов и аппаратов для массового  суспензионного

или глубинного культивирования клеточных и бактериальных культур. В

лабораторной  практике  ферментеры  применяются  для  ведения  научно-

исследовательских работ или отработки технологии массового культиви-

рования (пилотные биореакторы).

В общем случае ферментер состоит из культивационного сосуда, на-

сосов и соединительных трубопроводов (для подачи питательной  среды,

газов, инокулята  и отбора продукта), измерительных  приборов и регуля-

торов, управляющих  температурой среды в сосуде, ее рН, окислительно-

восстановительным потенциалом и другими параметрами.

В лабораторной практике наиболее часто применяются  ферментеры с 

емкостью  сосудов  от 1  до 20  л,  для  отработки  технологий –  от 30  до

400 л. Во  всех  случаях  питательной  средой  заполняется  не  более 75 %

объема сосуда.

Части ферментеров, контактирующие с питательной средой (сосуды,

соединительные  трубопроводы,  насосы  и  др.),  изготавливаются  из  био-

логически  пассивных,  химически  стойких  материалов,  позволяющих 

производить  стерилизацию  насыщенным  водяным  паром (качественная

нержавеющая  сталь,  фторопласт,  боросиликатное  стекло,  силиконовая 

резина).

Сосуды  ферментеров  имеют  цилиндрическую (реже  коническую)

форму. В них  размещены датчики температуры, рН, кислорода, а также 

система для  аэрации питательной  среды, производимой барботировани-

ем  газов (подача  газов  снизу  через  барботер)  через  питательную  среду 

или сочетанием продувки газов с механическим перемешиванием среды.

При использовании  механических мешалок их соединение с приводным

двигателем  производится  при  помощи  магнитных  муфт,  что  снижает 

риск  загрязнения  питательной среды. Помимо механического  и пневма-

тического перемешивания  используются также системы циркуляционно-

го (гидродинамического) перемешивания направленным током жидкости

по замкнутому контуру при помощи насосов.

Большинство перемешиваемых и аэрируемых культур во время  роста 

образуют  довольно  много  пены.  Образование  на  поверхности  среды 

культивирования слоя из пузырьков связано с наличием в среде поверх-

ностно-активных  веществ (ПАВ),  к  числу  которых  относятся  продукты

распада жиров  – мыла, а также белки. ПАВ включают как полярные ион-

ные, так и  неполярные группировки. Заряженные группы имеют сродст-

во к водной фазе, а нейтральные выталкиваются в воздушную фазу, где,

встраиваясь в  стенки  газовых пузырьков, увеличивают  время их жизни.

Умеренное  пенообразование  способствует  росту многих  аэробных мик-

роорганизмов (пенный слой – кислородный коктейль). Особое внимание

уделяется борьбе с избыточным пенообразованием, так как если не пре-

пятствовать  этому,  пена  смачивает фильтры  для  стерилизации  воздуха,

что  приводит  к  контаминации  культуры  посторонней  микрофлорой,

уменьшению  полезного объема биореактора, а  также выходу пены нару-

жу. Контроль  пенообразования  осуществляется  путем  введения  в  сосуд