Культура клеток. Получение и применение первичной монослойной культуры

В микробиологической практике продолжают широко использовать среды природного происхождения, химический состав которых известен недостаточно. Основу таких сред изготавливают из различного сырья животного или растительного происхождения: мяса и его заменителей, рыбы, крови животных, казеина, дрожжей, картофеля, сои и др. Вид и качество этого сырья по существу во многом предопределяют питательную ценность и стандартность применяемых основ и в значительной мере самих сред.

Наряду с белковыми  основами П. с. должны содержать зольные элементы (фосфор, серу, кальций, магний, железо) и микроэлементы (бор, молибден, кобальт, марганец, цинк, никель, медь, хлор, натрий, кремний и др.). Эти вещества необходимы для многих биосинтетических процессов у бактерий, однако потребность в них у разных видов микроорганизмов неодинакова. Так, например, марганец и железо требуются для кишечной палочки и возбудителей чумы, а калий — для молочнокислых бактерий. Марганец, кальций, магний, калий и железо стимулируют рост сибиреязвенной палочки, а магний, железо и марганец — рост бруцелл.

Для культивирования многих патогенных микроорганизмов необходимо наличие в среде так называемых факторов роста, представленных прежде всего водорастворимыми витаминами. Хотя бактерии не используют эти вещества как пластический или энергетический материал, тем не менее они являются обязательными компонентами питательных сред, т.к. их отсутствие тормозит образование многих ферментов. Факторами роста могут быть также некоторые органические кислоты, пуриновые и пиримидиновые основания и аминокислоты. Отдельные аминокислоты (L-цистин, D—пироглутаминовая кислота и др.) способны стимулировать рост одних микроорганизмов и, наоборот, угнетать рост других.

Питательные среды  должны содержать все необходимые  для выращиваемых микроорганизмов химические элементы в легко усвояемой форме и оптимальных количествах. Источником углерода в П. с. обычно служат отдельные углеводы, соли органических кислот, а также углерод, входящий в состав азотсодержащих соединений (белков, пептонов, аминокислот и др.). Потребности в азоте удовлетворяются при наличии в средах нативного животного белка (кровь, сыворотка, асцитическая жидкость и т.п.), пептонов, аминокислот, солей аммония и других азотсодержащих веществ (пуриновые и пиримидиновые основания, мочевина и др.). В питательные среды вносят минеральные соли, необходимые для микроорганизмов. Микроэлементы, требующиеся бактериям в ничтожно малых количествах, обычно попадают в П. с. либо с водой, которая используется для приготовления среды, либо с сырьем, входящим в состав П. с. Факторы роста поступают в среду с различными диализатами, экстрактами и аутолизатами в виде аминокислот, пептидов, пуриновых и пиримидиновых оснований и витаминов.

Белоксодержащее сырье, используемое для приготовления  П. с., подвергается гидролизу с помощью  различных ферментов (пепсина, трипсина, панкреатина, папаина, грибковых протеаз и т.п.) или кислот (реже щелочей). Целью гидролиза является растворение и расщепление протеина с образованием азотистых соединений, усвояемых микробной клеткой: пептонов, полипептидов, аминокислот, которые входят в состав получаемых таким путем гидролизатов. Для удовлетворения питательных потребностей каждого конкретного вида микроорганизмов используют те или иные гидролизаты в зависимости от их химического состава либо в состав П. с. одновременно вводят несколько гидролизатов в отработанных соотношениях.

Конструируемая  П. с. по своему составу и физико-химическим свойствам должна соответствовать  условиям естественного обитания микроорганизмов. Различия их питательных потребностей столь многообразны, что исключают  возможность создания универсальной  П. с. Поэтому современные принципы разработки сред основываются на всестороннем изучении питательных потребностей микроорганизмов.

Необходимо, чтобы  П. с. не только содержали нужные микробам питательные вещества, но и имели  оптимальную концентрацию водородных и гидроксильных ионов. Большинство патогенных микроорганизмов лучше растут на П. с. со слабощелочной реакцией (рН 7,2—7,4). Исключением являются холерный вибрион, оптимум роста которого находится в щелочной зоне (рН 8,5—9,0), и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6,2—6,8). Для предотвращения изменения рН в процессе культивирования микроорганизмов в П. с. добавляют фосфатные буферы — смесь одно- и двузамещенного фосфатов калия, концентрация которых в среде не должна превышать 0,5%.

Питательные среды  должны иметь достаточную влажность и быть изотоничными для микробной клетки, что обеспечивает нормальное течение в ней важнейших физико-химических процессов. Для большинства микроорганизмов оптимальной является среда, соответствующая 0,5% раствору натрия хлорида. Одним из существенных требований, предъявляемых к П. с., служит их стерильность, позволяющая выращивать чистые культуры микробов.

Важная роль в получении П. с. надлежащего  качества принадлежит методам их контроля. Для применяемых в производстве питательных сред главным показателем качества служит эффективность (урожайность) сред, т.е. способность накопления максимального количества биомассы полноценных по свойствам микроорганизмов или продуктов их биосинтеза (токсинов и др.). В оценке диагностических П. с. ведущим критерием является показатель чувствительности — способность обеспечить рост микроорганизмов в максимальных разведениях культуры возбудителя. В зависимости от назначения П. с. при оценке их качества используют также и другие показатели — стабильность основных свойств выращиваемых микроорганизмов и скорость их роста, выраженность дифференцирующих свойств и т.п.

Среда Игла

1. л-аргинина - 17,4

2. л-цистина  - 4,8

3. л-гистидина  - 3,1

4. л-изолейцина - 26,2

5. л-лейцииа  - 13,1

6. л-лизина - 14,6

7. л-метионина  - 7,5

8. л-фенилаланина - 8,3

9. л-треонина - 11,9

10. л-триптафана - 2,0

11. л-тирозина - 18,1

12. л-валина - 11,7

13. биотина - 0,24

14. холина - 0,12

15. холин-хлорида  - 0,14

16. витамина  В12 (птероилглютаминовой кислоты) - 0,44

17. никотинамида  - 0,12

18. пантотеновой  кислоты - 0,22

19. пантотената  кальция - 0,48

20. пиридоксаля  (пиридоксин хлоргидрата) - 0,20

21. тиамин-хлоргидрата  - 0,34

22. рибофлавина  - 0,04

23. хлористого  натрия - 5850,0

24. хлористого  калия - 373,0

25. фосфата натрия  однозамещенного (NaH2PO4 . Н2О) - 138,0

26. кальция хлористого - 111,0

27. двууглекислого  натрия (NaHCO3) - 1680,0

28. магния хлористого (MgCl2 . 6Н2О) - 102,0

29. глюкозы - 900,0

30. л-глютамина  - 146,2—292,3

31. пенициллина  - 50,0

32. стрептомицина  - 50,0

33. фенола красного - 5,0

34. воды  до 1000,0

      Приготовление.

      Раствор 1. В 500 мл воды, нагретой  приблизительно до  80°,  помешивая,

растворяют  указанные выше количества аминокислот, после  чего  добавляют  л-

глютамин и фенол-красный.

      Раствор  2.  В  100,0  мл  воды  растворяют  неорганические  соли,  за

исключением  двууглекислого  натрия   (NaHCO3),   смешивают   с   предыдущим

раствором неорганических солей и добавляют биотин и  витамин B12.

      Раствор 3. В 200,0 мл воды растворяют все витамины,  кроме биотина и

птеро-илглютаминовой кислоты, и антибиотики  —  пенициллин  и  стрептомицин.

Все растворы  стерилизуют  фильтрованием через  стеклянный   фильтр-нутч

(пористая стеклянная  пластина,  величина  пор  0,7—1,5)  либо  через

асбестоцеллюлозные  пластины Зейтца после предварительного промывания  водой,а затем —  приготовленным раствором.

      500 мл раствора 1 + 200 мл раствора 2 + 200 мл раствора 3 смешивают  и

доводят стерильной водой до 1000,0 мл. Можно добавить 1 мг инозита на 1 л.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ГЛАВА 2

ОПИСАНИЕ  ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

 

   2.1  Приготовление первичных  клеточных культур

 

 

Первичной- называется культура, полученная из ткани и выращиваемая in vitro до начала субкультивирования, то есть до первого посева. Первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку не все клетки способны прикрепляться к субстрату и выжить  in vitro. В процессе культивирования клеток происходит относительное обеднение культуры неделящимися или медленно делящимися клетками.

На первом этапе  получения первичной культуры проводят стерильное удаление фрагмента ткани, органа  животного и его механическую или ферментативную дезагрегацию. Ткань  измельчается до кусочков объемом до 1 - 3 мм,  кусочки ткани отмываются от эритроцитов раствором Хенкса с антибиотиками. Для дезагрегации ткани используют трипсин (0,25%  неочищенный или 0,01 - 0,05% очищенный) или коллагеназу (200 - 2000 ед/мл,  неочищенная) и другие протеолитические ферменты. Такой способ получения культуры обеспечивает высокий выход клеток.

Первичные культуры  могут быть также получены от кусочков ткани, объемом 1 мм, которые прикрепляются  к поверхности субстрата благодаря  собственной адгезивности или  наличию  насечек на чашке, или с помощью сгустка плазмы. В этих случаях будет происходить рост клеток из  фрагментов. Клетки,  мигрирующие из эксплантатов могут использоваться для  пассирования. Фрагменты  ткани  (эксплантаты)  переносятся  на  новые  чашки,  мигрирующие клетки могут удаляться пересевом, смесью версена и  трипсина,  а  остающиеся эксплантаты будут образовывать новые выросты. Известны такие первичные культуры, как культура фибробластов  куриного эмбриона, культура клеток почки теленка, лейкоциты. Главным преимуществом получения клеточных линий из первичных культур является наработка большого количества стабильного материала, пригодного для продолжительного использования.

 

 

 

 

 

 

   2.2  Получение монослойных перевиваемых культур клеток

 

 

   2.2.1 Требования к поверхности субстрата

 

 Большинство  нетрансформированных клеток млекопитающих  могут расти только в виде  монослоя, будучи прикрепленными  к субстрату: к другим клеткам  либо к стеклу (алюмоборосиликатное  стекло, чащемодифицированное), пластику (полистирол, полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целлофан и другие при условии правильной обработки этих полимеров – пластиковая поверхность должна быть специально обработана, чтобы клетки могли к ней прикрепиться, причем клетки эукариот не прикрепляются к пластиковым чашкам, предназначенным для бактериальных культур) или металлу (качественная нержавеющая сталь или титан). Поверхности клеток животных и поверхности традиционных культуральных сосудов из стекла и пластика, обладающие высокой поверхностной энергией, несут отрицательные заряды. Поэтому для прикрепления клеток необходимо образование поперечных сшивок с гликопротеинами (наиболее изученным является фибронектин,  присутствующий в сыворотке и других физиологических жидкостях), а также присутствие двух-валентных катионов кальция и магния. Суммарный отрицательный заряд поверхности субстрата (например, за счет образования отрицательно заряженных карбоксильныхг рупп) может достигаться предварительным воздействием химическими (окисляющие агенты) и физическими факторами (высоковольтный разряд, облучение УФ), что облегчает электростатическое прикрепление клеток. Поверхность культурального сосуда может быть также покрыта веществом, облегчающим прикрепление клеток. К природным субстратам, на которых растут клетки, относятся коллаген и желатин. Для этих целей используют коммерческие препараты коллагена для культуры тканей (например, «Витроген 100»), что позволяет избежать утомительной процедуры получения коллагена из крысиных хвостов.

В случае монослойных культур необходимо проводить систематические пассажи клеток, используя для этого культуры предыдущего рассева или музейные клетки, сохранившиеся в условиях консервации. Полноценная популяция может быть получена только от генерации,  состоящей из жизнеспособных клеток. Поэтому просмотр и оценка качества монослоя имеют решающее значение при выборе культур для пересева. Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение движения.  Когда две клетки приближаются друг к другу, то в зоне контакта прекращаются специфические движения клеточной мембраны. Первичные клетки, следовательно, не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений.

Этот феномен  характерен не только для первичных  клеток, но наблюдается также во многих клеточных линиях. Нетрансформированные клетки могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в таком покоящемся состоянии, но если их не пересеять, они погибают. Из сыворотки было выделено несколько факторов, обладающих способностью снимать контактное торможение.

Снижение распластывания клеток при достижении полного монослоя, а также ошаривание и прекращение  роста клеток при их откреплении  от подложки легли в основу представлений о тесной связи распластывания нетрансформированных клеток по мере их роста. Ослабленным контактным торможением характеризуются клетки, трансформированные вирусами, и такие клетки могут достигать более высокой конечной плотности. Считается, что эти клетки утрачивают зависящую от плотности регуляцию. Трансформированные клетки способны расти в плоть до полного истощения среды, и если после этого не наступает смена среды, то клетки быстро погибают.

Одним из факторов, лимитирующим рост клеток, является истощение в среде необходимых питательных компонентов. Следовательно, для получения высокой плотности клеток необходима периодическая замена питательной среды, а это может приводить к постоянному изменению состава среды, омывающей клетки, что весьма нежелательно.

Процесс подготовки клеточного монослоя к отделению  от стекла и формированию суспензии (обработка клеток в монослое 0,02 %  раствором химопсина в фосфатно-солевом  буфере или  0,1 % трипсином и 0,01 %   ЭДТА) происходит при комнатной температуре в течение 5-10 мин в зависимости от типа культуры и ее индивидуального состояния. Как только клеточный монослой достаточно разрыхляется и начинает отделяться от стекла, раствор фермента сливают, а в культуральную посуду заливают определенное количество ростовой среды. Этой средой тщательно смывают клетки со стенки сосуда и легким пипетированием способствуют образованию гомогенной взвеси. Полученную взвесь после подсчета числа клеток разводят ростовой средой до посевной дозы и используют при новых пересевах.