Разработка локальной поверочной схемы. Физические принципы спектрофотометрии Устройство спектрофотометра

• Для ионов группы железа (случай среднего кристаллического поля) кристаллическое поле слабее кулоновского, но значительно сильнее спин-орбитального взаимодействия: величина расщепления термов достигает 10000—20000 см -1.

- Случай сильного кристаллического поля, приводящего к изменению электронной конфигурации ионов, реализуется для ионов с 4d- и 5d-электронами, а также для редко наблюдаемых в минералах низкоспиновых состояний ионов группы железа. В оптических спектрах природных минералов этот случай практически не встречается.

Расстояние между подуровнями расщепления, обозначаемое Δ или 10Dq, является основным параметром кристаллического поля, характеризующим влияние лигандов на термы центрального атома. Сила кристаллического поля обратно пропорциональна расстоянию (центральный ион — лиганды)  приблизительно в пятой степени, т. е. уменьшение этого расстояния увеличивает силу кристаллического поля.

Искажения координационных полиэдров влекут за собой понижение локальной симметрии кристаллического поля и, как следствие, дополнительное расщепление энергетических уровней центрального иона.

Кроме того, положение энергетических уровней иона в кристаллическом поле зависит от параметров Рака В и С, учитывающих электростатическое взаимодействие электронов и отражающих состояние химической связи.

1.3.3.Теория молекулярных  орбиталей

 

Основная идея метода МО - молекулярные орбитали образуются путем составления соответствующих линейных комбинаций атомных орбиталей центрального иона и координирующих его лигандов. По теории МО предполагается, что структурной единицей для записи волновой функции является весь комплексный ион АВn, в котором 3d-, 4s- и 4p-орбитали центрального атома металла А в различной степени гибридизированы с р-орбитами лигандов  В.

Для решения вопроса о возможности эффективной комбинации центрального иона и лигандов необходимо выполнение следующих условий: 

1)  орбитали А и В должны  обладать одинаковыми свойствами  симметрии;

2) орбитали центрального атома  и лигандов должны по возможности полнее перекрываться (гибридизироваться);

3)   энергии орбиталей А  и В должны быть равными.

Каждая пара атомных орбиталей образует две молекулярные орбитали — связывающую и антисвязывающую,— порождающие два энергетических уровня: нижний (связывающая орбиталь), обычно полностью заполненный электронами, и верхний (несвязывающая орбиталь) пустой или, в зависимости от электронной конфигурации центрального иона, частично заполненный d-электронами.

В общем же случае все возможные типы сочетаний пар s-, p- и d-орбиталей сводятся всего к двум типам молекулярных σ- и π-орбиталей, каждая из которых может быть связывающей (σсв, πсв) или антисвязывающей (σ*, π*).

При анализе спектроскопических свойств комплексов, энергетические диаграммы которых построены с помощью МО, существенное значение имеет характер симметрии молекулярных σ- и π-орбиталей (четность — нечетность), определяющий правила отбора оптических переходов.

Правило Лапорта - переходы между состояниями одинаковой четности являются запрещенными, разрешены переходы между состояниями четное — нечетное.

Переход с переносом заряда - электрон под действием излучения переходит с орбитали, почти полностью сконцентрированной у одного атома, на орбиталь, которая полностью принадлежит другому атому.

Соответствующая полоса в спектре поглощения называется полосой или спектром переноса заряда.

Типы переноса заряда:

1.Переходы электронов с σ-орбитали на незанятые t2g- и eg-opбитали. Перенос заряда от лиганда к металлу (сокращенно лиганд → металл, или L→М).

2.Переходы электронов с заполненной π-орбитали, принадлежащей в основном лиганду, на e*g-, a*1g- или t1u-орбитали. При этом заряд также переносится от лиганда к металлу.

3.Особый тип переноса заряда  характеризует соединения, в которых  ионы металла имеют различные  валентности.

4.Тип  переноса заряда, обусловленный  электронным взаимодействием между ионами различных металлов. В спектрах некоторых соединений обнаружены полосы поглощения, связанные с переходами между электронными уровнями пар Ni—Mn, Сu—Mn, Fe—Ti и др.

 

2. Абсорбциометрические приборы

 

Основное назначение современных абсорбциометрических приборов — определение концентрации образца с исследуемым веществом посредством сравнения величин поглощения или пропускания световой энергии исследуемого образца и образца известной концентрации.

В настоящее время на рынке фотометрических приборов и в практических лабораториях можно встретить большое разнообразие различных по конструкции и характеристикам колориметров, фотометров и спектрофотометров.

Приборы могут отличаться:

• по форме представления информации (в единицах светопропускания, в единицах оптической плотности, в единицах концентрации или любых других значениях, по которым произведена калибровка);
• по способу построения и хранения калибровочных значений (автоматическое, ручное, длительное или краткосрочное);
• по способу подачи в прибор исследуемого раствора (проточная кювета, коммутируемая кювета, кюветы специальной конструкции, например, 96-луночный планшет и т.д.);
• по конструкции оптической системы (одноканальные и многоканальные);
• по виду источника излучения световой энергии (разнообразные лампы накаливания с телом накала из вольфрама, импульсные, газоразрядные лампы, светодиоды, лазеры).

Существуют и другие отличительные признаки, так или иначе влияющие на параметры и эксплуатационные характеристики приборов.

2.1.Типы абсорбционных спектрометров

 

При измерении поглощения вещества определяется его поглощающая способность на определенной длине волны λ1. Настроив монохроматор на эту длину волны, мы определяем разницу между значениями, полученными в присутствии и отсутствие исследуемого образца (на таком принципе основаны колориметры, фотоколориметры и большинство фотометров):

Аналогично можно отсканировать весь спектральный диапазон Δλ между λ1 и λ2, в присутствии и отсутствие образца (двулучевые спектрофотометры имеют два параллельных луча, один из которых проходит через сравнительную кювету, а второй — через кювету с образцом) и получить с помощью встроенного компьютера скорректированный спектр поглощения (с помощью вычислений на компьютере в режиме реального времени) (см. рис. 2, а)

До недавних пор логарифмирование данных измерений спектрометров осуществляли с помощью логарифмирующего усилителя, т.е. аппаратно. Теперь, с целью снижения стоимости оборудования, процесс логарифмирования выполняется с помощью программного обеспечения спектрофотометра, исходный сигнал в котором сохраняется в линеаризированном виде. Однако это порождает некоторые трудности.

1. Прежде чем рассчитать логарифм, необходимо с высокой точностью определить нулевую линию (т.е. «истинный нулевой сигнал»), что особенно важно при измерении небольших значений поглощения, незначительные отклонения могут вызвать существенные изменения величины поглощения и формы спектра.
2. Последующее логарифмирование линеаризированных данных, хранящихся в памяти, приводит к логарифмическому фотометрическому разрешению.
3. Измерение спектров поглощения быстросканирующими спектрофотометрами с одновременным логарифмированием линейного сигнала требует высоких скоростей преобразования, которые достижимы только с использованием быстродействующих микропроцессоров.

Рис. 2.Типы сканирующих абсорбционных спектрофотометров. (согласно Науману и Шредеру, 1987)

 

С точки зрения схемной реализации — усиление сигнала переменного тока производить проще, чем усиление сигнала постоянного тока. Поэтому сигнал постоянного тока, получаемый на фотодетекторе спектрометра, перед усилением преобразуют в сигнал переменного тока механическим прерывателем (см. рис. 2, б).

В отличие от последовательных измерений, измерение образца и сравнения можно проводить одновременно, предварительно расщепив луч света (расщепителем луча Y) и используя два отдельных фотодетектора D1 и D2, после чего два независимых сигнала преобразуются в спектр поглощения (рис. 2, в). Такой метод позволяет исключить ошибки измерения, вызванные флуктуациями источника света, но не компенсирует различия в чувствительности детекторов.

В сканирующем абсорбционном спектрометре, приведенном на рис. 2, г, применяется только один детектор. Измеряющий свет расщепляется на два луча (расщепителем луча Y), затем после прохождения образца, сравнения и прерывателя они соединяются обратным расщепителем луча Y. Затем с помощью фазочувствительного усилителя, который воспринимает сигнал сравнения с прерывателя, получают исправленный спектр поглощения. Такая конструкция сканирующего абсорбционного спектрометра применяется наиболее часто. Однако у него есть несколько недостатков. Вследствие ограниченной частоты прерывателя (60 Гц) и в соответствии с теоремой отбора, скорость сканирования длины волны не может быть выше 30 с на спектр в диапазоне от 400 до 800 нм. Иначе фотометрические ошибки и ошибки определения длины волны достигнут неприемлемо высоких значений. Обычно механическое расстояние между образцом/сравнением и фотодетектором D более 20 см. Таким образом, допустимый телесный угол света, излучаемого образцом, составляет 0,001. Это исключает, однако, возможность измерения мутных рассеивающих образцов наподобие присутствующих in vivo биологических и застеклованных при низких температурах.

Для того чтобы собрать как можно больше квантов света, конструкция спектрометра должна предусмотреть как можно больший телесный угол сбора света от образца (до 2π). Площадь катода отдельного фотоумножителя, как правило, бывает неоднородной с точки зрения эффективности. Поэтому, если два луча двулучевого спектрофотометра падают на слегка различающиеся площадки одного и того же фотокатода, то, даже в случае оптимальной юстировки, коррекция нулевой линии оказывается недостаточной, и это выражается в существенном отклонении от идеальной горизонтальной линии. В практически всех спектрометрах такого типа применяется оптическая последовательная корректировка, которая занимает много времени. В соответствии с правилом Гаусса, касающимся ошибки распространения луча, ошибки лучей образца и сравнения аддитивно влияют на конечный результат. На рис. 3 представлена конструкция типичного двулучевого спектрофотометра («Kontron Instruments GmbH»). Если вновь ввести второй детектор согласно рис. 2, д и компенсировать различие усиления обоими детекторами вторым световым источником переменного тока частотой fH, мы снимем ограничения в скорости сканирования. Образец, сравнение и детекторы размещаются очень близко друг к другу, что позволяет проводить измерения рассеивающих мутных образцов. Если требования к оптическим свойствам и разрешению по длине волны (порядка Δλ = ±0,5 нм) не очень высоки, что обычно бывает в химической и биологической молекулярной спектроскопии, то идеальным представляется использование конструкции Сейя - Намиока на основе голографической вогнутой решетки рис.4. Доступно быстрое спектральное сканирование мутных и сильно рассеивающих (in vivo) образцов, компактный дизайн, низкий уровень рассеянного света, большой динамический диапазон измерения и, что наиболее важно, встроенный компьютер, производящий все типы спектральных измерений. Такие спектрометры отличаются небольшими размерами, низкой стоимостью и высокой надежностью. Для каждого исследуемого образца не требуется последующее сканирование сравнительного образца. Сравнительный спектр, снятый раз и навсегда, сохраняется в виде коррекционной кривой в памяти компьютера, и спектр исследуемого образца автоматически корректируется в процессе сканирования без вмешательства человека.

Рис. 3. компоненты типичного двулучевого спектрофотометра («Kontron Instruments GmbH»)

 

Рис. 4.  Схема небольшого, но мощного монохроматора Сейя — Намиока на основе голографической вогнутой решетки.

 

2.2.Типы абсорбционных спектрометров видимого и ближнего ультрафиолетового диапазона

2.2.1.Колориметры и фотоколориметры

 

Фотоколориметры - приборы, предназначенные для определения количества окрашенного вещества путем измерения величин поглощения и пропускания в видимой части электромагнитного спектра.

Рис.5 Упрощенная схема фотоколориметра: 1 — источник световой энергии (лампа накаливания, импульсная лампа); 2 — полосовой светофильтр, пропускающий световой поток в полосе длин волн Δλ.; 3 — контейнер для исследуемых образцов (кювета); 4 — детектор (фотоприемник); Ф0 — падающий поток световой энергии; Ф — поток световой энергии, прошедший раствор, который поглотил часть энергии; Δλ. — полоса пропускания светофильтра использования.

Рис 6. Обобщенная структурная схема одноканального колориметра: 1 — источник световой энергии; 2 — диафрагма; 3 — оптическая система; 4 — полосовой фильтр; 5 — оптическая система; 6 — кювета; 7 — фотоприемник; 8 — аналого-цифровой преобразователь; 9 — микро-ЭВМ; 10 — индикатор; 11 — пульт оператора; 12 — интерфейс связи с внешней ЭВМ и регистрирующим устройством.

 

2.2.2.Спектрофотометры

 

Основное отличие спектрофотометра от фотоколориметра состоит в возможности пропустить через исследуемый образец световой поток любой требуемой длины волны, проводить фотометрические измерения, сканируя (просматривая) весь диапазон длин волн не только видимого (VIS) света — от 380 до 750 нм, но и ближнего ультрафиолета (UV) — от 200 до 380 нм.

Последнее обстоятельство не исключает целесообразности выпуска недорогих спектрофотометров, не имеющих источника ультрафиолетового излучения и работающих только в видимой части оптического диапазона волн.

Целью упомянутого и очень важного режима работы спектрофотометров — режима сканирования — является построение спектральной кривой поглощения (абсорбции) и нахождение на ней пиков, а также исследование процессов интерференции и поиск ложных пиков, приводящих к ошибочным результатам при спектрофотометрических исследованиях.

 Рис 7. 1 — монохроматор (источник монохроматического излучения световой энергии на длине волны λ); 2 — кювета с исследуемым раствором; 3 — детектор (фотоприемник); Ф0 — падающий поток световой энергии; Ф — поток световой энергии, прошедший через раствор, поглощающий часть энергии