Агароза

                               Активация Присоединение

Присоединение аминов к сефарозе, активированной бромцианом, приводит, таким образом, к замещенным изомочевинам. Так,

Сед>ароза, б результате реакции в нейтральной.и щелочной средах образуются группы, способные протонироваться и функционирующие- как ионообменники. Дальнейшее добавление аминов к N-заме- щенным изомочевинам приводит к образованию Мь Ыг-дизаме- щенных гуанидинов. В комбинации с гидрофобными цепами ал- киламинов образующиеся положительные заряды действуют как детергенты. В результате этого возрастает неспецифическая сорбция, что может рассматриваться как обратимая денатурация белков «детергеноподобными» производным^ атарозы и как следствие в некоторых случаях, например при элюировании пеницилли- назы с этилсефарозы 1 М раствором хлорида натрия, происходит инактивация фермента [90].

Образование катионных групп носителя на стадии Б может быть предотвращено использованием гидразидов вместо алифатических аминов. Образующиеся производные имеют р/С 4,2, и, следовательно, они не заряжены при нейтральных рН [37, 50, 91, 92]. Преимущества использования в качестве пространственных групп гидразидов детально обсуждаются в разд. 8.3.

Изучение реакции N-замещенной изомочевины, конъюгирован- ной сефарозой, с аминами и бычьим сывороточным альбумином [93] помогло понять расхождение между опубликованными данными о стабильности конъюгатов. Соединения, содержащие ну- клеофилы, например амины или белки, расщепляют связи изомочевины согласно приведенной выше схеме. Если расщепление связей наблюдается в отсутствие таких соединений, то это происходит, вероятнее всего, благодаря освобождению адсорбированных молекул аффинного лиганда, которые были плохо отмыты. Количество освобождающегося лиганда в результате очень медленного гидролиза изомочевины обычно очень мало и не мешает нормальному процессу аффинной хроматографии. Как показано в разд. 8.5, отщепление аффинного лиганда от специфического сорбента существенно главным образом в системах с высоким сродством или при выделении небольших количеств вещества. Шнапп и Шалитин [65] предотвращали отщепление аффинных лигандов под действием нуклеофилов после присоединения к сефарозе, активированной бромцианом, путем замены связи изомочевины более устойчивой связью гуанидина, для чего бромцианом активировали носитель, содержащий аминогруппы.

Степень активации агарозы, оцениваемая данными о емкости но связыванию небольших пептидов [1], прямо пропорциональна |>Н. Активация проводится при рН 11. Методика активации сефарозы бромцианом детально описана ниже [2, 12, 55].

(Активация агарозы бромцианом при контроле рН с помощью рН-метра

Отмытая и декантированная сефароза суспендируется в дистиллированной воде (1 :1). Работу проводят под тягой. Электроды рН-метра погружают в сус- Ьензию, в которую при постоянном перемешивании прибавляют небольшими пор-циями бромциан (50—300 мг на 1 мл набухшей сефарозы). рН суспензии поддерживают   добавляя раствор едкого натра. Концентрацию последнего выбирают в зависимости от количеств сефарозы и бромциана. Куатреказас [12] рекомендует использовать для 5—10 мл набухшей сефарозы и I—3 г добавляемого бромциана 2 М NaOH, а для 100—300 мл набухшей сефарозы и 20—30 г бромциана — 8 М NaOH. Температура не должна превышать 20 °С, если необходимо охлаждение, добавляют лед. Реакция заканчивается за 8—12 мин, После быстрого перенесения суспензии в воронку Бюхнера при постоянном отсасывании активированную сефарозу промывают охлажденным буферным раствором того же состава, который используется при последующей привязке аффинного лиганда. Объем буферного раствора для промывания должен быть в 10—15 раз больше объема раствора, в котором проводилась активация сефарозы. Промытая сефароза как можно быстрее суспендируется в равном объеме раствора аффинного лиганда. Согласно Куатреказасу [12], промывка, добавление раствора аффинного лигаида и смешивание не должны занимать более 90 с. Даже при низкой температуре активированная сефароза нестабильна.

Активированная бромцианом сефароза 4В поступает в продажу в виде лиофильно высушенного продукта, содержащего дек- стран и лактозу, которые перед использованием следует отмывать. Ниже приводится методика для привязки аффинного лиганда к активированной бромцианом сефарозе, предлагаемая фирмой Pharmacia.Требуемое количество геля замачивают для набухания в Ю-3 М соляной кислоте; Ю-3 М соляную кислоту используют также для промывки геля в течение 15 мин. 1 г лиофильно высушенного геля набухает до объема ~3,5 мл. Гель рекомендуется промывать в несколько приемов, используя на 1 г сухого геля 200 мл раствора. Сразу же после промывки добавляют раствор аффинного лиганда, который необходимо привязать к сефарозе. Оптимальные условия для связывания аффинного лиганда (рН, состав буфера н температура) зависят до определенной степени от характера лиганда. Как правило, реакция связывания наиболее эффективна при рН 8—10, но можно использовать и более низкие значения рН, если этого требует природа связываемого лиганда. Аффинный лиганд присоединяется в достаточных количествах даже и при этих рН, если увеличить количество бромциана при активации и количество лиганда при связывании, Аффинный лиганд, в особенности белкового характера, растворяют в буфере с высокой ионной силой (около 0,5) для предотвращения неспецифической адсорбции. Высокая ионная сила облегчает затем последующую промывку. Можно использовать карбонатный и боратиый буферы с добавками хлорида натрия.

      Количество связанного аффинного лиганда зависит от содержания его в реакционной смеси и объема геля, рН реакции, природы присоединяемого лиганда (числа реакционных групп и т. п.), а также от времени реакции и температуры. Например, при присоединении химотрипсина к 2 мл активированной бромцианом сефарозы при рН 8 из 10 мг присутствующего белка присоединяется только 5 мг, из 20 мг   8 мг, а из 30 мг         10 мг. При комнатной температуре (20—25 °С) присоединение обычно заканчивается за 2 ч, в то время как при более низких температурах рекомендуется оставлять реакционную смесь на ночь. Реакционную смесь следует перемешивать, однако не рекомендуется использовать магнитную мешалку, так как это может привести к механической деструкции геля.

Когда присоединение заканчивается, гель с привязанным аффинным лнгаи- дом переносят на пористый стеклянный фильтр и промывают тем же самым буферным раствором, в котором проводилось присоединение. Для удаления оставшихся активных групп фирма Pharmacia рекомендует блокировать их обработкой 1 М 2-аминоэтанолом при рН 8 в течение 2 ч. Продукт должен быть затемпромыт 4—5 раз другими буферными растворами с высоким и низким рН [например, ацетатным (0,1 моль/л, рН 4) и боратным (0,1 моль/л, рН 8,5) буферами, содержащими 1 моль/л хлорида натрия]. Как уже указывалось, все вещества, связанные не ковалентно, должны быть удалены в ходе промывок.

Активация агарозы бромцианом в концентрированном фосфатном буфере [54]

    Для активации больших количеств агарозы и для активации мембран из агарозы или тонких слоев агарозы, покрывающих стеклянные шарики, Порат и др. [54] разработали очень простой и воспроизводимый метод активации в щелочном фосфатном растворе очень высокой буферной емкости; при этом отпадает необходимость контроля рН и интенсивного перемешивания. Найдены условия для высокой, средней и низкой степеней активации, которые выбираются, исходя из природы связываемого аффинного лиганда. Кроме того для высокой степени активирования гелей, были выбраны условия как для гелей с низким содержанием агарозы (р= 1—4%), так и с высоким {/> = 4—8%) содержанием. Методики даны для гелей с разным содержанием (р, %) агарозы в набухшем геле.

Метод А. Высокоактивированные гели агарозы (р—1—4%)

     Набухший гель (10 г р %-ной агарозы) суспендируют в 2,5 р мл холодного (5—10°С) 5 М К-фосфашого буфера (3,33 моль К>Р04 +1,67 моль К2НР04 в 1 л раствора). Суспензию разбавляют дистиллированной водой до 20 мл и прибавляют небольшими порциями в течение 2 мин 0,1 р мл водного раствора бром­циана (100 мг/мл). Раствор в течение 10 мин (включая время, необходимое для прибавления бромциана) осторожно перемешивают при 5—10 °С. Продукт активации промывают на стеклянном фильтре холодной водой до нейтральной реакции.

Метод Б. Высокоьктивированные гели агарозы (р=4—8%)

    Гель агарозы промывают 2 М фосфатным буфером и отфильтровывают при отсасывании. 10 г р %-ной агарозы суспендируют в 2,5 р мл холодного фосфатного буфера и активируют, как в методе А, с 1,0 р мл водного раствора бром- циана.

Метод В. Среднеактивированные гели агарозы (р — 1—8%)

Методика идентична описанной  для метода А; для приготовления  суспензии используют 0,5 р мл буферного раствора и прибавляют 0,2 р мл бромциана.

Метод Г. Слабоактивированные гели агарозы (р=/—8%)

Методика аналогична описанной  для метода А; для приготовления  суспензии используют 0,12 р мл буферного раствора и прибавляют 0,05 мл бромциана.

Активированные продукты быстро промывают 0,25 М карбонатом натрия (рН 9), в котором проводили связывание химотрипсина, по методике, подобной той, которая используется для промывания продажной активированной сефарозы.

              Упрощенный метод активации агарозы бромцианом

 Бромциан растворяют в ацетонитриле (2 г/мл, т.е. 19 моль/л). Раствор устойчив при —20 "С и может храниться при этой температуре. Равные объемы 50%-ной (по объему) водной суспензии агарозы и растворы 2 М карбоната натрия смешивают и охлаждают во льду. Затем прибавляют ацетонитрильный раствор бромциана (0,2 г бромциана на 1 мл набухшей агарозы) и смесь 1—2 мин перемешивают. Активированный гель затем промывают и добавляют к раствору связываемого вещества (например, а 0,2 М бикарбонате натрия, рН 9,5). Преимуществом этого метода является его простота и существенное сокращение неприятных и опасных манипуляций с бромцианом во время взвешивания.

Высокая стабильность бромциана в  Ы-метил-2-пир- ролидоне использована Ни- шикавой и Бэйлоном при изучении влияния количества бромциана на активацию агарозы. На рис. 8.2 показано влияние ■бромциана на связывание 6-аминогексановой кислоты 6, 4 и 2%-ной агарозой. Бромциан прибавлялся в виде 16% -кого (по объему) водного раствора в N-ме- тил-2-пнрролидоне.

Конечное количество связанного аффинного  лиганда можно регулировать, изменяя количество бром­циана, вводимого при активации. Необходимо, чтобы используемые препараты бромциана были бес­цветными, а кристаллы практически не плавились. Желтоватоокрашенные препараты плохо реагируют. Изучение влияния концентрации е-аминокапроновой кислоты на ее связывание активированной бромцианом сефарозой показало, что высокая концентрация аффинного лиганда при коротком времени инкубации дает лучшие результаты, чем низкая концентрация при продолжительной инкубации.

Присоединение аффинных лигандов к агарозе с помощью бифункциональных оксиранов [71]

Бисоксираны (например, диглицидильный эфир бутандиола-1,4) были использованы для введения в агарозу реакционноспособ-

Метод пригоден для связывания Сахаров, которые образуют- эфирные овязи по своим гидравсильным группам. Белки и пептиды своими первичными аминогруппами образуют алкиламинные связи, С веществами, которые содержат тиольные группы, образуются тиоэфирные связи. Когда используется М-бис^.З-эиокси- пропокси) бутан, то между лигандом и цепью агарозы вводится пространственная группа, соответствующая цепи из 12 углеродных атомов. Под действием бисоксирана происходит поперечное сшивание углеводных цепей матрицы геля, которое повышает ее устойчивость. Это позволяет применять более жесткие условия для связывания и элюирования. Эти гели поступают в продажу под названием эпоксиактивированной сефарозы.

Активация, поперечное сшивание и связывание

1 г подсушенной при отсасывании  агарозы (сефароза 6В) промывают водой на воронке со стеклянным фильтром, а затем смешивают с 1 мл диглици- :дилового эфира и 1 мл 0,6 М едкого натра, содержащего 2 мг/мл борогидрида иатрия. Суспензию перемешивают (вращением) при 25 "С в течение 8 ч, затем реакцию останавливают; гель промывают большим объемом воды (500 мл) на воронке со стеклянным фильтром. Связывание проводят, смешивая 1 г подсушенной отсасыванием оксиран-агарозы с 2 мл раствора вещества, подлежащего иммобилизации, в буфере с требуемым рН. Белки связываются при рН 8,5—>10- 'ш температуре 25 "С, продолжительность реакции 15—48 ч.

Связывание аминокислот, аминов, углеводов  и других более или менее устойчивых соединений можно проводить при  рН 9—11, 25—75°С, с продолжительностью реакции 4—15 ч. Увеличить выход в реакции связывания можно, повысив рН и температуру реакции.

Уменьшение выхода для связывания белков при низких рН и температуре? можно компенсировать увеличением продолжительности реакции. Остающиеся оксирановые группы, способные к дальнейшему связыванию, блокируются, например, 24-часовой обработкой 2 М глицином или 2-аминсэтанолом, предпочтительно при рН >8,5 и температуре 23 °С. Наряду с водными растворами, можно работать в присутствии также органических растворителей, таких, как днметилформа- мид или дкоксэн (содержание их в конечной смеси должно соответствовать 50%),

Обратимая ковалентная иммобилизация  ферментов с помощью тиол-дисульфидиого обмена

Карлсон и др. использовали эпоксиактивированную ага- розу в качестве основы для приготовления меркаптооксипропилового эфира агарозы, хоторую они применили для ковалентной иммобилизации а-амилазы и химотрипсина с помощью тиол-дисуль- фидного обмена. Методика включает две стадии: а) тиолирова- ние ферментов метил-3-меркаптопропиоимидатом и б) связывание тиолированных ферментов со смешанными дисульфидными производными агарозы, лолученными при взаимодействии меркаптоок- сипропилового эфира агарозы с г^'-дипиридилдисульфидом. Полученные препараты иммобилизованных ферментов обладали высокой активностью. Иммобилизованная а-амилаза была приме­нена для непрерывного гидролиза крахмала. Когда препарат терял свою ферментативную активность, неактивный белок удаляли восстановлением дисульфидных связей и гель повторно использовали для связывания свежей активной тиолированной «-амилазы.