Агароза

                   Министерство образования и науки, молодежи и  

            спорта Украины  Луганский национальный университет

                                     имени Тараса Шевченко

 

 

 

 

 

 

 

Реферат на тему:

“АГАРОЗА”

 

 

 

 

                                                                            

                                                                           Выполнила: студентка 3-го курса, 

                                                                           Специальность “биология”        

                                                                           Баярова Д.Т

                                                                           Проверил: И.В Дяченко

 

 

План:

 

1. Гели агар  

2.Агарозы - получение, свойства

3. Активация Присоединение

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Актуальность  проблемы. Необходимость всестороннего  изучения полимерных студней определяется все возрастающей ролью их в практике получения таких полимерных изделий  как волокна, пленки, при создании искусственной пищи, медицинских материалов и т.д.

Цель  работы. В процессе изучения полимерных студней в последнее время  успешно решается целый ряд задач: например, фазовое состояние студней, термодинамические особенности  процесса застудневания полимерных систем, морфология студней, влияние термодинамического качества растворителя и другие.

При изучении фазового разделения системы полимер-растворитель при застудневании основное внимание уделяется установлению закономерностей формирования студневой сетки /полимерного каркаса/ и реологическим свойствам, определяемым полимерной компонентой, влиянию растворителя на формирование фазы, обогащенной полимером.

В задачу нашей работы входило комплексное  изучение формирования структуры как  твердой, так и жидкой фаз, установление их взаимного влияния и роли в  формировании студневой структуры в целом.

Научная новизна работы заключается в  детальном изучении механизма студнеобразования  на основе водных студней агарозы с привлечением разнообразных методов и рассмотрении зависимости свойств студней от различных факторов - концентрации, температуры, растворителя, добавок. Установлено наличие ассоциатов даже в разбавленных растворах агарозы.Впервые получены фракции агарозы и определены их молекулярные массы.Методом распределения в водной и водно-органической двухфазных системах впервые количественно оценена относительная гидрофобность агарозы и ее водно-солевых растворов.

Практическая  значимость заключается в том,что в качестве объекта исследования выбрана агароза, являющаяся главным компонентом многотоннажного пищевого полимера - агара, применяемого в различных отраслях народного хозяйства /например,пищевая, кондитерская промышленность, медицина, биология/. Агароза является одним из классических природных полимеров, образующих студни в структурно-сложном растворителе - воде.

Установленные закономерности открывают возможность  более рационального использования  студне образователя в промышленности и выбора оптимальных условий при проведении технологических процессов производства.

Надо  отметить,что особый интерес представляют именно водные растворы и студни агарозы, поскольку вода является обязательной составной частью всех клеток и тканей человека, животных и растительных организмов, саше разнообразные биохимические процессы протекают именно в водной среде. Изучение водных растворов полимеров к тому же может дать сведения и о самой воде.

Между тем в отечественной литературе данных об этом полисахариде недостаточно, а об агарозе отечественного производства не удалось обнаружить сведений вообще. Учитывая вышесказанное, исследование агарозы, выпускаемой нашей промышленностью, само по себе представляет интерес.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Гели агарозы

          Агароза —это особо чистая фракция природного, линейного полисахарида, агара, выделяемого из морских водорослей. Мы с ним уже встречались.

 

Молекулярная масса одиночных  нитей агарозы лежит в пределах 10-100 тысяч дальтон. Агароза для электрофореза поставляется в виде лиофилизированного (высушенного в вакууме) порошка. Гелеобразование происходит при остывании даже очень разбавленного горячего раствора агарозы в буфере. При температуре 84-96° С (а у некоторых типов агарозы уже при 70°) нити полимера плавятся и образуют с окружающей водной средой однородную прозрачную жидкость. Она обладает ярко выраженным температурным гистерезисом — застывает при температуре порядка 40°С. Остывая до этой температуры, даже 0,4% -ные растворы агарозы образуют прочные гели. У легкоплавких типов агарозы температура затвердевания снижается до 30°. Такая особенность агарозы облегчает все манипуляции с ее растворами, не опасаясь их затвердевания. Более того,, расплавленную на кипящей бане взвесь агарозы в воде охлаждают до 50-55° и только при этой температуре добавляют концентрат буфера и все другие добавки, а затем заливают в форму для электрофореза. Это удобно и не связано с возникновением тепловых деформаций.

Остывая, хаотически ориентированные  нити затвердевшей агарозы благодаря множественным водородным связям между нитями собираются в жгуты. Эти жгуты свободно перекрещиваясь, создают в окружающей их жидкости очень крупнопористую и, вместе с тем, жесткую пространственную сетку.

Размер пор геля агарозы, естественно, связан с концентрацией ее исходного раствора. Можно привести некоторые рекомендации по выбору этой концентрации, почерпнутые из опыта электрофореза нуклеиновых кислот:

Для нуклеиновых кислот вирусов  и крупных плазмид 0,4-0,5%.

Для рестриктов ДНК, содержащих 5—20 тысяч пар оснований 0,7-0,8%.

Для более коротких рестриктов ДНК и двунитевых РНК рео-вируса 1,5%.

Для рибосомальных РНК — 1,75%.

Для иРНК и рестриктов ДНК до 1000 п.о. — 2% .

Приготовление пластины для электрофореза  в агарозе очень просто. Нужного размера стекло оклеивают со всех сторон по ребру сплошной липкой лентой так, чтобы ее верхний край на несколько миллиметров выступал над поверхностью стекла. Последнее кладут на строго горизонтальный столик. Прямо на стекло выливают рассчитанный объем еще жидкого раствора агарозы. Затем в него близ одного края стекла устанавливают гребенку, подобную той, которую ставят в форму ПААГ перед его полимеризацией. Только на этот раз гребенку погружают в агарозу перпендикулярно стеклу (зубцы ее, однако, не должны касаться стекла). После застывания агарозы гребенку вынимают, образуя таким образом «колодцы» для препаратов. Электрофорез ведут в горизонтальном положении (в треках), накладывая фитили, идущие от резервуаров с буферами. Рабочее значение напряженности поля 2-5 В/см.

ДНК, особенно двунитевые, а также и РНК хорошо окрашиваются желтым флюоресцентным красителем — бромистым эти-дием. Этот краситель несет положительный заряд, что позволяет ему взаимодействовать с фосфатными группами нуклеиновых кислот. Кроме того он способен интеркалировать (встраиваться) между оснований двунитевой ДНК, что приводит к резкому усилению его флюоресценции при освещении ультрафиолетовым светом. Окраску можно производить и после электрофореза вымачиванием геля в течение 0,5—1 часа в водном растворе красителя (1 мкг/мл) или же вводить его непосредственно в гель. В последнем случае можно следить за движением полос в геле. Стеклянную пластину в этом случае освещают УФ-лампой снизу. Чувствительность окраски высока. Можно наблюдать и фотографировать полосы, содержащие 0,01 мкгДНК.

В конце электрофореза ДНК можно  зафиксировать в геле осаждением из раствора, вымачивая гель в 70% -ном  этаноле.

 

Агарозы - получение, свойства

      Агароза - линейный компонент агара, точно так же, как и амилоза в крахмале. В агарозе для электрофореза/иммунодиффузии удалены остаточные сульфогруппы, которые в агаре присутствуют от природы (их удаляют для предотвращения электроэндосмоса при форезе), а в легкоплавкой агарозе (low melting point), определённые группы вводятся для изменения физических свойств.

     Агароза — это особо чистая фракция природного линейного полисахарида агара, который извлекают из некоторых видов морских водорослей. В полимерной цепи агарозы чередуются beta-D-галактопираноза и 3,6-ангидро-alfa-L-галактопираноза. Молекулярная масса ее составляет 104—105. Гелеобразование идет, как уже указывалось, путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы образуют прочные гели уже при концентрации 0,3%. При температурах 84—96° (а у специальных типов—уже при 70°) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость — «плавится». Вязкость расплавленного 1%-ного раствора агарозы составляет 10—15 сП, что примерно соответствует вязкости 50%-ного раствора сахарозы при комнатной температуре. Растворы агарозы характеризуются ярко выраженным гистерезисом: они затвердевают, образуя гель, при значительно более низких температурах (36—42°). У легкоплавких типов агарозы эта температура снижается до 30°. Такая особенность облегчает манипуляции с расплавленной агарозой—можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную на кипящей бане агарозу предварительно охлаждают до 50—55° и уже при этой температуре дозируют и заливают в формы; это удобно и не связано с возникновением значительных тепловых деформаций.

 Гели агарозы не вполне прозрачны, однако это обусловлено не наличием примесей, а своего рода «кристаллизацией» геля и свидетельствует, скорее, о чистоте агарозы. Затвердевший гель представляет собой не вполне равновесную систему: со временем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жидкость. Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом — очень медленно. Тем не менее гели агарозы перед опытом следует выдерживать в течение, по крайней мере, 12 ч (открытые пластины для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных «гелей агарозы.

 Температуры плавления и  гелеобразования зависят от содержания  в агарозе метоксильных групп, которое может достигать 3—4%. Наличие этих групп затрудняет гелеобразование. В агарозе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Их присутствие существенно влияет не только на температуры плавления и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза.

 Разнообразные буферы, детергенты  и другие добавки смешивают  с раствором агарозы в горячем виде (при 50—60°). Они не препятствуют ее застыванию. Впрочем, надо иметь в виду, что высокая концентрация агентов,' диссоциирующих водородные связи, несколько затрудняет образование геля. Например, гели обычной агарозы с 6 М мочевиной плавятся за 1,5 мин при 75°, но не застывают за 1 ч. при 20° [Langridge et al., 1980]. Контакт с кислородом воздуха не мешает застыванию агарозы, поэтому плоские гели для горизонтального электрофореза готовят путем заливки дозированного объема расплавленной агарозы на строго горизонтальную стеклянную пластинку нужного размера. Тем не менее горячую смесь агарозы с буфером имеет смысл кратковременно деаэрировать под вакуумом.

 Выбор концентрации агарозы, т. е. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний Размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответствует' диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гельфильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом поле…

 

Матрица агарозы

«Ножка» привязана к гелю агарозы эфирной связью. «Ножка» привязана к гелю агарозы бромциановым методом,меняется даже при кратковременном (2—3-часовом) выдерживании при комнатной температуре в 0,1 М едком натре и 1 М соляной кислоте. Для аффинной хроматографии веществ, слабо растворимых в воде, можно использовать также растворы в 50%-ном диметилформамиде или в 50%-ном этиленгликоле. Лиофильное высушивание можно осуществлять только после добавления в водную суспензию сорбента защитных веществ, например декстра- на, глюкозы и сывороточного альбумина.

Стабильность матрицы агарозы можно значительно повысить путем сшивания эпихлоргидрином  2,3-днбромпропанолом или дивинилсульфоном [34, 58] перед активацией бром- цианом. Устойчивость в водной среде как в кислой, так и в щелочной областях (рН 3—14) растет с увеличением числа сшивок. Возможность использования хаотропных солей, главным образом для элюирования антител, обсуждается в разд. 10.2. Благодаря сшиванию гели приобретают большую устойчивость в органических растворителях, таких, как спирт, диметилформамид, тетра- ги-дрофуран, ацетон, диметилсульфокснд, хлороформ, хлористый метилен, дихлорэтан и дихлорэтан — пиридин (1 : 1).

 

Связывание аффнниых лигандов с агарозой, активированной бромцианом

     Наиболее широко используемый метод связывания аффинного лиганда с сефарозой разработан Поратом, Аксеном и Эрнбаком он основан на активации носителя бромцианом. Аффинные лиганды связываются посредством первичных алифатических или ароматических аминогрупп в непротонированной форме. Ак- сен и Эрнбак предположили, что при этом образуются три различные структуры, а именно N-замещенные карбаматы, N-за- мещенные имидокарбонаты и N-замещенные изомочевины. N-за- мещенная мочевина, как предположил Свенсон на основании работ по изоэлектрофокусированию, является преобладающей формой. В'ильчек и др. [93] представили различные химические доказательства того, что N-замещенные изомочев'ины действительно являются главными продуктами реакции между аминами и сефарозой, активированной бромцианом, как это показано на следующей схеме: