Фитохимический анализ алкалоидов

                                

где a – содержание алкалоидов в пятне хроматограммы, найденное по калибровочному графику, мг.; V – объём хлороформного раствора, полученного при растворении сухого остатка, мл.; V₁ – объём хлороформногораствора, нанесенного на хроматограмму, мл.; m – масса навески сырья, г.; ω – потеря в массе сырья при высушивании,%.

Содержание платифиллина-основания должно быть не менее 0,3%.

VI. Методика количественного определения алкалоидов в рожках спорыньи эрготаминового штамма (Cornua Secalis cornuti stamm Ergotamini) (ФС 42-1432-80).

Рожки спорыньи, паразитирующей на ржи, содержат индольные алкалоиды – производные лизергиновой и изомерной ей изолизергиновой кислот. Основными являются эргометрин, эрготамин, эргокристин, эргокриптин, эргокорнин и др.

Количественное определение  алкалоидов проводится колориметрическим  методом. 3 г. (с погрешностью не более 0,01 г.) свежеизмельчённого порошка спорыньи, просеянного сквозь сито с размером отверстий 0,315 мм., обезжиривают в аппарате Сосклета в течение 8 ч. петролейным эфиром (температура кипения 40-60ºС). Обезжиренный порошок высушивают при температуре не выше 30ºС и переносят количественно в колбу с притёртой пробкой вместимостью 100 мл., приливают 30 мл. этилового эфира и оставляют на 10 мин. Затем прибавляют 0,13 г. свежепрокаленного оксида магния, тщательно растёртого с 6 мл. воды; смесь непрерывно встряхивают в течение 2 ч., затем прибавляют 6 г. безводного Na₂SO₄, сильно встряхивают в течение 5 мин., дают отстояться и быстро процеживают через вату. 15 мл. фильтрата (1,5 г. спорыньи) помещают в делительную воронку и извлекают 4 раза по 20 мл. 2%-ным раствором винной кислоты; колбу с объединёнными виннокислыми извлечениями помещают на водяную баню и нагревают до 40-50ºС для удаления остатков эфира.

Охлаждённый раствор  процеживают через вату в мерную колбу вместимостью 200 мл., колбу  и воронку с ватой тщательно промывают 2%-ным раствором винной кислоты и доводят объём раствора до метки той же кислотой (раствор А). К 2 мл. раствора А прибавляют 4 мл. реактива Ван-Урка, перемешивают и оставляют раствор на свету на 30 мин., после чего колориметрируют на ФЭК-М с зелёным светофильтром (длина волны 530-540 нм.) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Процентное содержание эргоалкалоидов в сырье x вычисляют по формуле:

                                     

где a – количество эргоалкалоидов в 1 мл. раствора А, г., найденное по калибровочному графику; ω – потеря в массе сырья при высушивании, %.

Построение калибровочного графика. Для построения калибровочного графика готовят серию разведений эрготамина тартрата-стандарта (ФС 42-1070-76) в 2%-ной винной кислоте разбавлением исходного раствора эрготамина тартрата-стандарта. Для этого сначала готовят исходный раствор: точную навеску 0,0113 г. эрготамина тартрата-стандарта (0,0100 г. основания) растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл. в 2%-ной винной кислоте и доводят этой же кислотой до метки. Полученный раствор содержит 0, 0001 г. эрготамина-основания в 1 мл. (исходный раствор). В пробирках вместимостью 10 мл. готовят ряд разбавлений раствора.

К полученным растворам  прибавляют 4 мл. реактива Ван-Урка, тщательно  перемешивают и оставляют раствор на свету на 30 мин., после чего колориметрируют в тех же условиях, что и в основном опыте. Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс количество граммов эрготамина-основания, а на оси ординат – соответствующее значение оптической плотности колориметрируемых растворов.

Для определения содержания эрготамина на стартовую линию хроматографической бумаги марки «С» (55*16 см.) узкой полоской наносят из микропипетки 0,4 мл. эфирного извлечения (0,04 г. спорыньи). Бумагу импрегнируют 50%-ным спиртовым раствором формамида, pH которого 7,05-7,20, оставляя стартовую линию 2 см. сухой; тщательно отжимают избыток формамида между листами фильтровальной бумаги, стартовую линию опрыскивают из пульверизатора тем же раствором формамида. В течение 10 мин. полоску бумаги высушивают на воздухе в тёмном месте.

Хроматографирование проводится в затемнённой камере нисходящим методом, в системе бензол – петролейный  эфир (t_кип=70-100ºС) (6:1) до продвижения фронта 40-45 см., после чего бумагу высушивают и просматривают в ультрафиолетовом свете, отмечают светящуюся полоску эрготамина. Эту полоску вырезают по всей ширине бумаги – с одного конца вырезают зубчики, другим концом помещают в кювету с 1%-ной винной кислотой, которая находится в камере, насыщенной водой, и алкалоиды элюируют 1%-ной винной кислотой, элюат собирают в пробирку с делениями. За 18 ч. собирают 3-6 мл. элюата, доводят водой до 8 мл., тщательно перемешивают. К 2 мл. полученного раствора прибавляют 4 мл. реактива Ван-Урка и через 30 мин. колориметрируют в тех же условиях, что и при определении суммы алкалоидов.

По калибровочному графику  находят содержание эрготамина в 1 мл. испытуемого раствора. Процентное содержание x вычисляют по формуле:

                                    

где a – количество эрготамина в 1 мл. испытуемого раствора, г., найденное по калибровочному графику; ω – потеря в массе сырья при высушивании, %. Содержание эрготамина в пересчёте на абсолютно сухое сырьё должно быть не менее 0,2%.

VII. Методика количественного определения секуринина в побегах секуринеги (Cormus Securinegae) (ФС 42-109).

Побеги секуринеги полукустарниковой (Securinega suffruticosa) сем. молочайных – Euphorbiaceae содержат алкалоиды – производные конденсированной бициклической системы пиперидина и пирролидина.

Количественное определение  секуринина в сырье проводится полярометрическим  методом. 100 г. воздушно-сухого сырья, измельчённого  до величины частиц 2 мм., помещают в  коническую колбу вместимостью 2000 мл. и заливают 1000 мл. дистиллированной воды. Содержимое колбы взбалтывают 5 мин. и оставляют до следующего дня. После этого повторно взбалтывают 5 мин. и водную вытяжку отфильтровывают.

600 мл. водного фильтрата  помещают в делительную воронку вместимостью 1000 мл., подщелачивают концентрированным раствором аммиака (проба с фенолфталеиновой бумагой) и алкалоиды исчерпывающе извлекают хлороформом 3-4 раза порциями 100, 50 и 50 мл. до полного извлечения (проба с раствором кремневольфрамовой кислоты).

Из объединённого хлороформного  извлечения алкалоиды извлекают 10%-ной H₂SO₄ 2-3 раза по 50 мл. в делительной воронке вместимостью 500 мл. Объединённый сернокислый раствор вновь подщелачивают концентрированным раствором аммиака (проба с фенолфталеиновой бумагой) и алкалоиды исчерпывающе извлекают этиловым эфиром 4-5 раз по 30-50 мл. (проба с раствором кремневольфрамовой кислоты). Объединённые эфирные извлечения сушат безводным Na₂SO₄ (10-15 г.) и фильтруют через бумажный фильтр в сухую колбу. Промывают сульфат натрия небольшими порциями этилового эфира до отсутствия алкалоидов и фильтруют через тот же фильтр. Эфир отгоняют на водяной бане досуха. Остаток эфира удаляют струёй воздуха.

Сухой остаток в колбе  растворяют в 5 мл. 95%-ного этилового  спирта и количественно переносят  в мерную колбе вместимостью 25 мл., объём раствора доводят до метки этиловым спиртом, тщательно перемешивают и определяют угол вращения в трубке длиной 0,5-2,0 дм. (поляриметр марки СМ).

Процентное содержание секуринина x вычисляют по формуле:

                                         

где ά – измеренный угол вращения, градусы; V – объём растворителя, взятого для извлечения алкалоидов, мл.; V₁ – объём извлечения, взятого для анализа, мл.; V₂ – объём этилового спирта, взятого для растворения алкалоидов, мл.; m – масса навески сырья, г.; l – толщина слоя жидкости (длина трубки), дм.; ω – потеря в массе сырья при высушивании, %; 1080 – удельное вращение чистого секуринина.

Содержание секуринина должно быть не менее 0,1 % на абсолютно  сухое сырьё.

VIII. Методики количественного определения берберина в корнях барбариса обыкновенного (Radices Berberidis vulgaris).

Корни барбариса обыкновенного (Berberis vulgaris) сем. барбарисовых – Berberidaceae содержат алкалоиды производные изохинолина: берберин, ятроррицин, пальматин и др. Считают, что берберин может быть как в форме четвертичного аммонийного основания, так и в альдегидной или карбинольной форме.

1. Количественное определение  берберина спектрофотометрическим  методом (ФС 42-1152-78). Количественное  определение берберина в корнях  барбариса по данной методике основано на селективном извлечении берберина в его карбинольной форме и отделении от алкалоидов фенольной природы на стадии экстракции сырья.

В УФ-спектре бисульфата берберина в 2%-ной H₂SO₄ имеется ряд интенсивных полос поглощения. Для количественного определения в данном методе используется наиболее длинноволновая полоса поглощения (λ_max=420 нм.).

Для определения содержания берберина от средней пробы цельного сырья отделяют не менее 1 кг., который измельчают до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм., тщательно перемешивают, отбирают не менее 250 г. сырья, которые измельчают до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм. Затем отбирают 25 г. сырья и доводят его измельчение до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм.

0,5 г. (с погрешностью  не более 0,0001 г.) сырья помещают  в коническую плоскодонную колбу  вместимостью 100 мл. (с притёртой  пробкой), прибавляют 0,5 мл. 25%-ного NaOH, тщательно перемешивают стеклянной палочкой до получения однородной увлажнённой массы, закрывают пробкой и оставляют при комнатной температуре на 2 ч. Затем в колбу прибавляют 50 мл. этилового эфира, закрывают пробкой, взвешивают (с погрешностью не более 0,01 г.). Содержимое колбы осторожно перемешивают круговыми движениями в течение 10 мин., взвешивают и потерю массы пополняют этиловым эфиром. Содержимое колбы вновь осторожно перемешивают, дают отстояться, затем берут осторожно, не взмучивая сырья, пипеткой 15 мл. эфирного извлечения, помещают в делительную воронку вместимостью 100 мл. и проводят извлечение алкалоидов 2%-ной H₂SO₄ порциями 20, 10 и 10 мл. (до отрицательной реакцией с кремневольфрамовой кислотой). Объединённые кислотные извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл. и доводят объём раствора до метки 2%-ной H₂SO₄. После тщательного перемешивания раствор спектрофотометрируют при длине волны 420 нм. в кювете с толщиной слоя 1 см.

Процентное содержание берберина бисульфата x в пересчёте на абсолютно сухое сырьё вычисляют по формуле:

                                        

где 50 – объём эфирного извлечения, мл.; 50 – объём сернокислого извлечения, мл.; 15 – объём эфирного извлечения, взятого для анализа, мл.; 128 – удельный показатель поглощения берберина бисульфата при длине  волны 420 нм.; D – оптическая плотность сернокислого извлечения; m – масса навески сырья, г.; ω – потеря в массе сырья при высушивании, %.

2. Количественное определение берберина спектрофотометрическим методом с применением хроматографии в тонком слое сорбента. Метод основан на разделении алкалоидов в тонком слое сорбента и определении содержания берберина спектрофотометрическим методом.

Точная навеска (0,5-1 г.) измельчённых корней барбариса, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм., помещают в колбу вместимостью 50 мл., приливают 10 мл. 95%-ного этилового спирта и нагревают с обратным холодильником на водяной бане, поддерживая слабое кипение этилового спирта в течение 30 мин. После охлаждения до комнатной температуры отмеряют микропипеткой 0,2 мл. извлечения (надосадочной жидкости) и наносят на стартовую линию хроматографической пластинки с закреплённым слоем силикагеля сплошной полосой длиной 5-7 см. на расстоянии 1,5 см. от нижнего края пластинки. Для определения зоны берберина в правой части пластинки на стартовую линию наносят раствор берберина бисульфата (3-5 капилляров) в виде пятна (диаметр пятна 0,5-0,7 мм.).

После высушивания пластинку  помещают в хроматографическую камеру. Для проявления используется система: раствор аммиака концентрированный  – хлороформ – этиловый спирт (1:3:3). Система растворителей используется для хроматографирования однократно. Толщина слоя растворителей в хроматографической камере около 5 мм.; экспозиция при комнатной температуре 30-40 мин.

Хроматограмму после  высушивания просматривают в  УФ-свете, отмечают на хроматограмме зону, соответствующую берберину, и соскабливают этот участок сорбента скальпелем колбу вместимостью 25 мл. Берберин 4 раза элюируют 0,1 н H₂SO₄ при нагревании в течение 1 мин. на водяной бане. Кислоту отмеряют с помощью бюретки: первый раз 4 мл., а затем три раза по 2 мл. Полноту элюирования определяют по отсутствию флюоресценции силикагеля в УФ-свете. Элюат каждый раз сливают декантацией в другую колбу вместимостью 25 мл. Для удаления следов силикагеля объединённый элюат центрифугируют в течение 5 мин. (1000 об./ми.). Оптическую плотность элюата измеряют на спектрофотометре СФ-4А на фоне контроля при длине волны 345 нм. в кювете с толщиной слоя 1 см. Контролем служит элюат чистого силикагеля с той же пластинки, снятый с площади, равной площади пятна берберина. Процентное содержание берберина в образце x рассчитывают на абсолютно сухую массу сырья в пересчёте на бисульфат берберина:

                                            

где V – объём этилового спирта, взятого для извлечения, мл.; V₁ – объём извлечения, нанесённого на хроматограмму, мл.; V₂ – объём элюата берберина, мл.; D – оптическая плотность элюата; ω – потеря в массе сырья при высушивании, %; m – масса навески сырья, г.; 646 – удельный показатель поглощения берберина бисульфата.

 

 

 

 

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

Несмотря на современное  развитие методов исследований, в  изучении алкалоидов остаётся ещё много  неизвестного. В частности, не до конца  выяснен механизм биосинтеза ряда терпеноидных алкалоидов, ведутся работы по изучению регуляции биосинтеза алкалоидов и их предшественников, взаимосвязи между различными видами обмена веществ в растении и о роли алкалоидов в обмене веществ в растении.

Возможно, будут пересмотрены и уточнены методы качественного  и количественного анализа сырья и препаратов, содержащих алкалоиды. Также необходимо отметить, что, несмотря на достаточно широкое применение алкалоидов в современной терапевтической практике, всё-таки их потенциальные возможности ещё не раскрыты в полной мере. Изыскание новых лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья, содержащего алкалоиды, а также создание новых препаратов с улучшенными фармакотерапевтическими показателями на основе уже имеющихся препаратов может занять достойное место в будущей научно-исследовательской работе.