Фитохимический анализ алкалоидов

5. Хранение. Список Б.

6. Срок годности. 2 года.

 

5. МЕТОДИКИ  КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ  В ЛЕКАРСТВЕННОМ РАСТИТЕЛЬНОМ  СЫРЬЕ

 

I. Методика количественного определения алкалоидов в листьях красавки (Folia Belladonnae), траве красавки (Herba Belladonnae), корнях красавки (Radices Belladonnae), листьях белены (Folia Hyoscyami) и листьях дурмана (Folia Stramonii).

В листьях, траве и корнях красавки (Atropa belladonna), листьях белены (Hyoscyamus niger) и дурмана обыкновенного (Datura stramonium) сем. паслёновых (Solanaceae) содержатся алкалоиды производные тропана. В этих видах растительного сырья преобладает гиосциамин, переходящий под влиянием щелочей в оптически инактивный атропин. Кроме того, в значительно меньшем количестве содержится скополамин и другие близкие по строению алкалоиды.

По данной методике определяется содержание суммы алкалоидов. Определение проводится титрометрическим методом (обратное титрование).

10 г. измельчённого  сырья, проходящего сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм., помещают в колбу вместимостью 250 мл., приливают 7 мл. концентрированного раствора аммиака, 150 мл. этилового эфира и в течение 1 ч. смесь часто и энергично взбалтывают, эфирное извлечение быстро фильтруют через вату в колбу вместимостью 200 мл., прикрывая воронку часовым стеклом. К фильтрату прибавляют 5 мл. воды, энергично взбалтывают и оставляют в покое до просветления эфирного слоя, после чего отмеривают с помощью мерного цилиндра 90 мл. эфирного извлечения в делительную воронку вместимостью 200 мл. Цилиндр дважды ополаскивают этиловым эфиром порциями по 10 мл., которые присоединяют к отмеренному эфирному извлечению.

Из эфирного извлечения алкалоиды извлекают последовательно 20, 15, 10 мл. 1%-ной HCl до полного их извлечения (проба с реактивом Майера или раствором кремневольфрамовой кислоты), каждый раз фильтруя через смоченный водой фильтр (диаметром 5 см.) во вторую делительную воронку такой же вместимости. Фильтр дважды промывают 1%-ной HCl по 5 мл., присоединяя промывную жидкость к общему кислотному извлечению.

Кислотное извлечение подщелачивают 10%-ным раствором аммиака до щелочной реакции по фенолфталеину и алкалоиды извлекают последовательно 20, 15, 10 мл. хлороформа, взбалтывая по 3 мин.

Каждую порцию хлороформного  извлечения фильтруют через бумажный фильтр, на который предварительно помещают 4-5 г.свежепрокалённого безводного сульфата натрия, смоченного хлороформом. Фильтрование проводят в колбу для отгонки вместимостью 100 мл. Фильтр промывают хлороформом дважды по 5 мл. Хлороформ отгоняют на водяной бане до 1-2 мл., остаток хлороформа в колбе удаляют продуванием воздуха до полного исчезновения запаха растворителя.

Сухой остаток растворяют в 15 мл. 0,02 н HCl при подогревании на водяной бане и оттитровывают избыток последней 0,02 н NaOH до появления жёлтой окраски (индикатор – метиловый красный).

1 мл. 0,02 н HCl соответствует 0,005780 г. алкалоидов (считая на гиосциамин). Процентное содержание в пересчёте на абсолютно сухое сырьё x вычисляют по формуле:

                                   

где V – объём 0,02 н NaOH, пошедшего на титрование, мл., m – масса навески сырья, соответствующая объёму эфирного извлечения, г., ω – потеря в массе сырья при высушивании, %.

II. Методика количественного определения скополамина в семенах дурмана индейского (Semina Daturae innoxiae) (ФС 42-1005-75).

Плоды и семена дурмана  индейского (Datura innoxia) сем паслёновых (Solanaceae) содержит тропановые алкалоиды (скополамин, гиосциамин, норгиосциамин и др.). Большое количество приходится на долю скополамина.

Определение содержания скополамина в растительном сырье проводится гравиметрическим методом.

100 г. сырья, измельчённого  и просеянного сквозь сито  с отверстиями диаметром 1 мм., взвешенного с погрешностью не  более 0,01 г., помещают в колбу  вместимостью 1 л., заливают 800 мл. дихлорэтана и 50 мл. раствора аммиака, встряхивают в течение 20 мин. и оставляют до следующего дня. Затем содержимое колбы вновь взбалтывают в течение 20 мин. и после отстаивания дихлорэтановое извлечение фильтруют, точно измеряют его объём, переносят в делительную воронку вместимостью 1 л., алкалоиды извлекают 10%-ной уксусной кислотой 6 раз по 20 мл. до полного извлечения (проба с кремневольфрамовой кислотой).

Полученное уксуснокислое  извлечение промывают 2-3 раза хлороформом  порциями по 20 мл., затем уксуснокислое извлечение подщелачивают карбонатом калия по фенолфталеиновой бумаге и алкалоиды извлекают этиловым эфиром 5-6 раз порциями по 30 мл. (пробы с кремневольфрамовой кислотой). Эфирные извлечения фильтруют через бумажный фильтр с 3-4 г. безводного Na₂SO₄ в предварительно взвешенную (с погрешностью не более 0,0001 г.) круглодонную колбу вместимостью 200 мл., фильтр с Na₂SO₄ промывают 30 мл. сухого этилового эфира, который присоединяют к основному эфирному извлечению, эфир отгоняют досуха на водяной бане. Остаток растворяют в 15-20 мл. хлороформа, приливают 20-25 мл. 1%-ной пикриновой кислоты в хлороформе, 2-3 мл. воды и 20 мл. бензола. Содержимое колбы перемешивают стеклянной палочкой в течение 45 мин. и оставляют на 24 ч.

Выпавший осадок пикрата скополамина отфильтровывают на предварительно взвешенном стеклянном фильтре № 3. Фильтр с осадком и колбу с пикратом скополамина, оставшимся на стенках, сушат в сушильном шкафу при 100-105ºС в течение 3 ч. до постоянной массы и после охлаждения взвешивают. Масса пикрата скополамина, находящегося в колбе и собранного на стеклянном фильтре, составляет общее количество выделенного пикрата скополамина. 1 г. пикрата скополамина содержит 0,559 г. скополамина-основания.

Процентное содержание скополамина-основания x на абсолютно сухое сырьё вычисляют по формуле:

                                      

где m – масса навески сырья, соответствующая объёму дихлорэтанового извлечения, взятого для анализа, г.; a – количество пократа скополамина, г.; ω – потеря в массе сырья при высушивании, %; 0,559 – коэффициент пересчёта пикрата скополамина на скополамин-основание.

III. Методика количественного определения алкалоидов в траве термопсиса (Herba Thermopsidis) (ГФ X, ст. 327).

В траве термопсиса (Thermopsis lanceolata) сем. бобовых – Fabaceae содержатся алкалоиды – производные хинолизидина (термопсин, гомотермопсин, пахикарпин, анагирин, метилцитизин и др.).

По данной методике определяется сумма алкалоидов титрометрическим методом (прямое титрование).

Около 10 г. (точная навеска) травы термопсиса, измельчённой и просеянной сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм., помещают в колбу вместимостью 400-500 мл., приливают 200 мл. хлороформа, подщелачивают 10%-ным раствором аммиака до ясно щелочной реакции по фенолфталеину, взбалтывают на вибрационном аппарате в течение 1,5 ч. Хлороформное извлечение процеживают через вату в мерный цилиндр. Точно отмеренный объём хлороформного извлечения, соответствующий определённой навеске сырья, переносят в колбу и хлороформ отгоняют до объёма 5 мл. Остаток переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл., колбу дважды промывают 5 мл. хлороформа, который присоединяется к основному хлороформному раствору. Хлороформный раствор взбалтывают с 1%-ной HCl по 10 мл., затем по 5 мл. до полного извлечения алкалоидов (пароба с реактивом Майера или с раствором кремневольфрамовой кислоты). Объединённые солянокислый извлечения подщелачивают 10%-ным NaOH по фенолфталеину и трижды извлекают хлороформом порциями по 15, 10 и 5 мл. Хлороформные извлечения фильтруют через фильтр, в который помещают 2 г. безводного Na₂SO₄. Фильтр с Na₂SO₄  трижды промывают хлороформом порциями по 10 мл., которые присоединяют к основному фильтрату. Хлороформ отгоняют на водяной бане до 2-3 мл. и его остаток удаляют продуванием воздуха. Полученный в колбе остаток растворяют в 5 мл. этилового спирта и прибавляют 15 мл. воды, 2 капли растврора метилового красного и 1 каплю метиленового синего и титруют 0,1 н HCl до появления сине-фиолетового окрашивания.

1 мл. 0,1 н HCl соответствует 0,0244 г. алкалоидов термопсиса:

                                         

где V – объём 0,1 н HCl, израсходованный на титрование, мл.; m – масса навески сырья, г.; ω – потеря в массе сырья при высушивании, %; V₁ – объём хлороформного извлечения, взятого для анализа, мл.

IV. Методика количественного определения цитизина в траве термопсиса очередноцветкового (Herba Thermopsidis alterniflorae) (ФС 42-1281-79).

Трава термопсиса очередноцветкового (Thermopsis alterniflora) сем. бобовых – Fabaceae содержит алкалоиды производные хинолизидина; основным является цитизин.

Трава термопсиса очередноцветкового наряду с семенами термопсиса ланцетного служит промышленным источником получения  цитизина. Определение содержания цитизина в траве термопсиса очередноцветкового проводят хроматоспектрофотометрическим методом.

Около 10 г. (с погрешностью до 0,01 г.) сырья, измельчённого и просеянного  сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм., помещают в плоскодонную колбу  вместимостью 250 мл., приливают 100 мл. хлороформа, подщелачивают 5 мл. концентрированного раствора NH₄OH, закрывают пробкой и встряхивают на вибрационном аппарате в течение 2 ч. или оставляют при комнатной температуре на 12-15 ч., после чего встряхивают полчаса.

Хлороформное извлечение фильтруют через вату в мерный цилиндр; 50 мл. фильтрата переносят в коническую колбу вместимостью 100 мл. и хлороформ отгоняют до объёма 1-2 мл. Остатки хлороформа удаляют продуванием воздуха. К остатку пипеткой приливают 2 мл. 0,1 н раствора NaOH и растирают стеклянной палочкой до полного удаления комочков, затем прибавляют 8 мл. воды и перемешивают. К содержимому приливают пипеткой 10 мл. 0,2 н HCl, перемешивают 5-6 мин. и фильтруют через тройной бумажный складчатый фильтр диаметром 7 см.

По 0,04 мл. фильтрата (70-90 мкг.) наносят калиброванной микропипеткой на линию старта (на 4 средние полосы) хроматографической пластинки; первую полосу оставляют контрольной; на шестую полосу наносят в качестве «свидетеля» 0,04 мл. (80 мг.) 0,2%-ного спиртового раствора цитизина-основания.

Растворы наносят полосами длиной 1-1,2 см. каждая. Во время нанесения проб пластинку подсушивают тёплым воздухом. Пластинку с нанесёнными пробами высушивают на воздухе в течение 5 мин., затем помещают в предварительно насыщенную (не менее 2 ч.) вертикальную камеру со смесью растворителей: 95%-ный этиловый спирт – хлороформ – концентрированный раствор аммиака (40:80:0,05) и хроматографируют восходящим методом при комнатной температуре.

Через 1,5-2 ч., когда фронт  растворителей пройдёт около 16 см., пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 3 мин. и просматривают в УФ-свете при длине волны 360 нм. Отмечают участки с пятнами на уровне «свидетеля». Цитизин просматривается на синем фоне пластинки в виде фиолетовых пятен. Для проверки полосу со «свидетелем» и одну полосу с испытуемым раствором проявляют реактивом Драгендорфа.

Участки сорбента с пятнами, находящимися на уровне проявленного пятна цитизина (испытуемого раствора и пятна «свидетеля»), и такой  же участок сорбента с контрольной  полосы количественно переносят в колбы со шлифом, заливают 10 мл. 95%-ного этилового спирта и встряхивают на вибрационном аппарате в течение 1 ч. Затем растворы переносят в пробирки для центрифугирования и центрифугируют 15 мин. при скорости вращения 4000 об./мин. или фильтруют через двойной бумажный складчатый фильтр.

Оптическую плотность  полученного элюата измеряют на спектрофотометре СФ-4А или СФ-16 в кювете с толщиной слоя 10 мм. при длине волны 311 нм., используя в качестве раствора сравнения  элюат с контрольной полосы.

Процентное содержание цитизина x в пересчёте на абсолютно сухое сырьё вычисляют по формуле:

                                  

где 100 – объём хлороформа, взятого для извлечения суммы  алкалоидов из сырья, мл.; 50 – объём  хлороформного извлечения, взятого для анализа, мл.; 20 – объём солянокислого раствора суммы алкалоидов, мл.; V – объём солянокислого раствора суммы алкалоидов, нанесённого на хроматограмму, мл.; 10 – объём элюата, мл.; 434 – удельный показатель поглощения цитизина при длине волны 311 нм., полученный на приборе, использованном при разработке метода; m – масса навески сырья, г.; ω – потеря в массе сырья при высушивании, %; D – оптическая плотность элюата при длине волны 311 нм.; 1,11 – поправочный коэффициент на неполное элюирование цитизина с хроматограммы; K – инструментальная поправка на используемые кюветы и спектрофотометр.

V. Методика количественного определения платифиллина в траве крестовника плосколистного (Herba Senecionis platyphylloidis).

Крестовник плосколистный (Senecio platyphylloides) сем. астровых – Asteraceae содержит алкалоиды – производные пирролизидина (платифиллин, сенецифилин). В растительном сырье они содержатся в основном в виде N-оксидов.

По данной методике проводится определение платифиллина в восстановленной  форме хроматоэлектроколориметрическим методом.

Аналитическую пробу  сырья измельчают до размера частиц 2 мм., берут навеску сырья массой 20 г. (с погрешностью не более 0,01 г.), помещают в колбу вместимостью 1 л., заливают 500 мл.5%-ной H₂SO₄; сюда же добавляют 4 г. цинковой пыли, смесь перемешивают, встряхивают, закрывают ватным тампоном, оставляют стоять в течение 6 ч. при периодическом встряхивании и затем кислотное извлечение фильтруют через бумажный фильтр.

100 мл. фильтрата помещают  в делительную воронку, подщелачивают концентрированным раствором аммиака (по фенолфталеину) и алкалоиды исчерпывающе извлекают этиловым эфиром порциями 70, 30, 30 мл. и т.д. (пробы на полноту извлечения с 1%-ным раствором кремневольфрамовой кислоты). Эфирные извлечения объединяют, сушат безводным Na₂SO₄, отфильтровывают и отгоняют досуха на водяной бане. Сухой остаток растворяют в 5 мл. хлороформа. 0,05 мл. полученного раствора наносят на линию старта стеклянной пластинки размером 6*18 см. с закреплённым слоем силикагеля марки КСК. Пластинку с нанесенной пробой высушивают на воздухе в течение 5-10 мин., а затем помещают в хроматографическую камеру с метиловым спиртом и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителя дойдет до конца пластинки, её вынимают из камеры, сушат сначала на воздухе, в течение 5 мин., затем в сушильном шкафу 30 мин. при температуре 50ºС, охлаждают на воздухе и опрыскивают реактивом Драгендорфа. При этом на пластинке должно появиться пятно платифиллина (R_f около 0,36) и выше – пятно сенецифиллина (R_f около 0,50). Проявленное пятно платифиллина обводят препаровальной иглой. Отмеченный участок счищают в делительную воронку вместимостью 50 мл., в которую затем прибавляют 15 мл. 1%-ной HCl и встряхивают в течение 3 мин. При этом образовавшийся на адсорбенте комплекс алкалоида с реактивом Драгендорфа разрушается. Затем в воронку прибавляют 0,2 мл. 1%-ного раствора тропеолина 000 – II и 10 мл. хлороформа, вновь встряхивают в течение 3 мин. и окрашенный хлороформный слой, содержащий соединение алкалоида с тропеолином, фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный хлорофором, в мерную колбу вместимостью 50 мл. Экстракцию хлороформом повторяют ещё два раза, объём раствора в колбе доводят до метки хлороформом, перемешивают и интенсивность окраски раствора опрелделяют при помощи фотоэлектроколориметра ФЭК-56М со светофильтром № 5 (λ=490 нм.) на фоне хлороформа в кювете с толщиной слоя 10 или 50 мм. в зависимости от интенсивности окраски раствора. Количество платифиллина в пятне хроматограммы в мкг. находят по калибровочному графику. Процентное содержание платифиллина в виде основания в абсолютно сухом сырье x вычисляют по формуле: