Фитохимический анализ алкалоидов

Чаще всего используют следующие системы растворителей: 1) хлороформ – ацетон – диэтиламин (5:4:1); 2) хлороформ – диэтиламин (9:1); 3) н-бутанол – метиловый спирт  – диэтиламин (17:1:2); 4) хлороформ –  метиловый спирт – уксусная кислота(18:1:1); 5) бензол – метиловый спирт (19:1); 6) хлороформ – этиловый спирт (9:1); 7) ацетон – раствор аммиака (95:5); 8) хлороформ – этиловый спирт (8:2).

После высушивания ТС хроматограммы обрабатывают теми же реактивами, что и хроматограммы  на бумаге.

4. Спектральный анализ. С целью идентификации алкалоидов кроме качественных реакций и хроматографического анализа определяют температуру плавления, удельное вращение, брутто формулу, молекулярную массу, получают ряд производных, определяют их константы. Кроме того, для идентификации алкалоидов широко используют УФ, ИК, ПМР, масс-спектры. При этом нет необходимости снимать одновременно спектры исследуемого вещества и известного образца, поскольку последний можно взять из литературы.

УФ, ИК, ПМР, масс-спектры  особенно широко используются при установке структуры алкалоидов, так как интерпретация спектров позволяет установить наличие или отсутствие сопряжённых двойных связей и различных функциональных групп (карбонильной, N-метильной, гидроксильной и др.), ароматического цикла и др. Так, например, в ИК-спектре атропина полосы поглощения при 1740 см^-1 указывают на наличие карбонила сложноэфирной связи; 2940 см^-1 – спиртового гидроксила. В УФ-спектре атропина отмечаются  λ_max=252, 258, 262 нм, характерные для сопряженных двойных связей в ароматическом цикле.

Полосы поглощения при 3220-3480 см^-1 в ИК-спектре морфина типичны для фенольного и спиртового гидроксилов. В УФ-спектре морфина λ_max=284 нм указывает на присутствие ароматического цикла.

Методики качественного  анализа.

1. Приготовление извлечения из растительного сырья.

1) 1 г. измельчённого растительного сырья помещают в колбу вместимостью 100 мл., заливают 25 мл. 1%-ной HCl и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. После охлаждения извлечение фильтруют через бумажный фильтр (извлечение А).

2) 2 г. измельчённого растительного сырья помещают в колбу вместимостью 100 мл., добавляют 1 мл. 19%-ного раствора аммиака и 20 мл. хлороформа и оставляют на 1 ч. при периодическом перемешивании. Хлороформное извлечение отфильтровывают через вату в делительную воронку вместимостью 100 мл. и алкалоиды извлекают 15 мл. 1%-ной HCl (извлечение Б).

2. Качественные реакции  (общие реакции, реакции осаждения). Извлечение А или Б разливают  в пробирки по 1 мл. и в каждую  пробирку осторожно, по каплям, добавляют соответствующий реактив на алкалоиды. При наличии алкалоидов тотчас или через некоторое время должен образоваться осадок.

Интенсивность осадка зависит  как от количественного содержания алкалоидов, так и от чувствительности алкалоида к реактиву.

1) Реактив Майера. С большинством алкалоидов в слабокислых и нейтральных растворах этот реактив образует белый или желтоватый осадок. Чувствительность алкалоидов к этому реактиву весьма различна: стрихнин и бруцин осаждаются в разведении 1:150000, морфин – 1: 25000, а кофеин, колхицин реактив Майера не осаждает.

2) Реактивы Вагнера и Бушарда. С большинством алкалоидов в слабокислых растворах эти реактивы образуют бурые осадки.

3) Реактив Драгендорфа. Многие алкалоиды в кислых растворах дают оранжево-красные или кирпично-красные осадки.

4) Реактив Марме. С алкалоидами реактив Марме даёт белые или желтоватые осадки, часто растворимые в избытке реактива. Чувствительность некоторых алкалоидов к этому реактиву невелика. Атропин, колхицин, вератрин и некоторые другие алкалоиды осаждаются из сравнительно концентрированных растворов, а кофеин этим реактивом совсем не осаждается.

5) Раствор танина. В подкисленных растворах алкалоиды дают с танином беловатые или желтоватые аморфные осадки.

6) Раствор кремневольфрамовой кислоты. Большинство алкалоидов весьма чувствительны к этому реактиву и в слабокислых растворах образуют беловатые осадки.

7) Раствор фосфорномолибденовой кислоты. Это один из наиболее чувствительных реактивов. С алкалоидами он образует желтоватые осадки, которые приобретают через некоторое время синее или зелёное окрашивание вследствие восстановления молибденовой кислоты.

8) Раствор фосфорновольфрамовой кислоты. Фосфорновольфрамовая кислота со многими алкалоидами даёт беловатые осадки.

9) Раствор пикриновой кислоты. Пикриновая кислота образует с рядом алкалоидов осадки (пикраты) жёлтого цвета. Некоторые алкалоиды пикриновой кислотой не осаждаются (кофеин, морфин, аконитин, теобромин), другие же осаждаются только из концентрированных растворов (например, атропин).

10) Раствор пикролоновой кислоты. Со многими алкалоидами пикролоновая кислота даёт жёлтые осадки (пикролонаты).

3. Приготовление реактивов.

1) Реактив Майера: 1, 358 г. дихлорида ртути растворяют в 60 мл. воды, приливают раствор 5 г. иодида калия в 10 мл. воды и общий объём доводят водой до 100 мл.

2) Реактив Вагнера: 1, 27 г. иода растворяют в 100 мл. раствора 2 г. иодида калия в воде.

3) Реактив Бушарда: 1г. иода растворяют в 50 мл. раствора 2 г. иодида калия в воде.

4) Реактив Драгендорфа: раствор 1-0,85 г. нитрата висмута основного растворяют в 40 мл. воды и добавляют 10 мл. уксусной кислоты; раствор 2-20 г. иодида калия растворяют в 50 мл. воды. Смешивают равные объёмы растворов 1 и 2. К 10 мл. полученной смеси добавляют 100 мл. воды и 20 мл. уксусной кислоты.

5) Реактив Марме: 10 г. CdI₂ растворяют в 100 мл. 20%-ного горячего раствора KI.

6) Раствор танина: 10 г. танина растворяют в 90 мл. воды и добавляют 10 мл. этилового спирта.

7) Раствор кремневольфрамовой кислоты: 1 г. кремневольфрамовой кислоты растворяют в воде и объём доводят водой до 100 мл.

8) Раствор фосфорномолибденовой кислоты: 1 г. фосфорномолибденовой кислоты растворяют в воде и объём доводят водой до 100 мл.

9) Раствор фосфорновольфрамовой  кислоты: 1 г. фосфорновольфрамовой кислоты растворяют в воде и объём доводят водой до 100 мл.

10) Раствор пикриновой кислоты: 1,23 г. пикриновой кислоты растворяют  в 100 мл. воды.

11) Раствор пикролоновой кислоты: 1 г. пикролоновой кислоты растворяют в воде и объём доводят водой до 100 мл.

4. Хроматографический анализ.

1) Приготовление извлечения из  растительного сырья. 1 г. измельчённого  растительного сырья (трава термопсиса  ланцетного, семена термопсиса ланцетного, листья красавки, листья дурмана  обыкновенного, семена дурмана  индейского и др.) помещают в колбу вместимостью 100 мл., заливают 25 мл. 1%-ной HCl и оставляют на 1 ч. при периодическом перемешивании или нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. После охлаждения извлечение фильтруют через вату в делительную воронку вместимостью 100 мл. Фильтрат подщелачивают концентрированным раствором аммиака до щелочной реакции по фенолфталеину, и алкалоиды извлекают 5 мл. хлороформа (извлечение В).

2) Хроматография на бумаге (трава  термопсиса ланцетного, семена термопсиса  ланцетного). На полоску хроматографической бумаги (длина 30-40 см., ширина 12 см.) на стартовую линию, находящуюся на расстоянии 2-3 см. от нижнего края, капилляром или специальной пипеткой наносят около 0,1 мл. извлечения В из травы термопсиса и из семян термопсиса, растворы цитизина, метилцитизина и пахикарпина. Расстояние от бокового края полоски хроматографической бумаги и между пятнами – 2 см. Диаметр пятен не должен превышать 5 мм.

Полоску хроматографической бумаги с  нанесёнными на неё растворами (после  высушивания) помещают в хроматографическую камеру, в которую предварительно (за сутки) налита разделительная система: н-бутанол – укссная кислота – вода (5:1:4).

Нижний край хроматограммы погружают  в жидкость примерно на 3-5 мм (экспозиция – 14-15 ч.).

После высушивания хроматограмму обрабатывают (опрыскивают из пульверизатора) реактивом Драгендорфа. На жёлтом фоне появляются оранжевые или оранжево-красные пятна (алкалоиды).

3) Хроматография в тонком слое  сорбента (трава термопсиса ланцетного, семена термопсиса ланцетного). На стеклянную пластинку (размер 12*9 см.) с закреплённым слоем силикагеля марки КСК на стартовую линию, находящуюся на расстоянии 1,5 см. от нижнего края, наносят капилляром или специальной пипеткой около 0,1 мл. извлечения В из травы термопсиса, семян термопсиса, растворы цитизина, метилцитизина, пахикарпина. Расстояние от бокового края и между пятнами около 1,5 см. Диаметр пятен не должен превышать 5 мм. После высушивания пластинку помещают в хроматографическую камеру, в которую предварительно налита разделительная система: хлороформ – ацетон – диэтиламин (5:4:1). Экспозиция 30-40 мин. После тщательного высушивания хроматограмму обрабатывают (опрыскивают из пульверизатора) реактивом Драгендорфа. На жёлтом фоне появляются оранжевые пятна (алкалоиды).

4) Хроматография в тонком слое  сорбента (листья красавки, семена  дурмана индейского). На стеклянную  пластинку (размер 12*9 см.) с закреплённым  слоем силикагеля марки КСК  на стартовую линию, находящуюся  на расстоянии 1,5 см. от нижнего  края, наносят капилляром или специальной пипеткой около 0,1 мл. извлечения В из листьев красавки, семян дурмана индейского, растворы гиосциамина, скополамина и атропина. Расстояние от бокового края и между пятнами около 1,5 см. Диаметр пятен не должен превышать 5 мм. После высушивания пластинку помещают в хроматографическую камеру, в которую предварительно налита разделительная система: хлороформ – ацетон – диэтиламин (5:4:1) – система I или ацетон – раствор аммиака (95:5) – система II.

Толщина слоя жидкости около 5 мм. Экспозиция 30-40 мин. После тщательного  высушивания хроматограмму обрабатывают (опрыскивают из пульверизатора) реактивом  Драгендорфа. На жёлтом фоне появляются оранжевые пятна (алкалоиды).

 

3.3. Количественное  определение

 

Весь процесс количественного определения алкалоидов в растительном сырье можно разделить на три основных этапа (стадии): 1) извлечение алкалоидов из растительного сырья; 2) очистка полученных извлечений и, если требуется по методике, разделение смеси алкалоидов на индивидуальные соединения; 3) определение содержания алкалоидов.

1. Извлечение алкалоидов. При количественном определении  алкалоиды из растительного сырья,  так же как и при их выделении,  извлекают или в виде оснований,  или солей.

1) Извлечение алкалоидов в виде оснований. При извлечении алкалоидов в виде оснований соли алкалоидов, в виде которых они содержатся в растениях, переводят в основания. Это достигается обработкой сырья различными щелочами. При количественном определении алкалоидов в растительном сырье чаще всего используют растворы аммиака и едкого натра, а также карбонат натрия и гидроксид кальция. Выбор щёлочи зависит от свойств и строения алкалоидов. Извлечение свободных оснований алкалоидов проводится органическими растворителями, не смешивающимися с водой, обычно хлороформом, этиловым эфиром или дихлорэтаном.

2) Извлечение алкалоидов  в виде солей. Соли алкалоидов  в большинстве своём хорошо  растворяются в воде и спиртах  (этиловый, метиловый). Обычно алкалоиды  экстрагируют 1-2%-ной серной, соляной, винной, уксусной кислотой или подкисленным спиртом.

2. Очистка извлечения. Для очистки извлечений чаще  всего проводится повторное переведение  солей алкалоидов в водный  раствор и свободных оснований в органический растворитель. Кроме того, для очистки извлечений, а также для разделения алкалоидов широко используется хроматографический метод (колоночная хроматография, хроматография в тонком слое сорбента и на бумаге).

3. Определение содержания  алкалоидов. Количественное содержание алкалоидов можно определить: гравиметрическим, титрометрическим, колориметрическим, полярометрическим, полярографическим, спектрофотометрическим, денситометрическим или другими методами.

 

4. ЛЕКАРСТВЕННЫЕ  РАСТЕНИЯ И СЫРЬЁ, СОДЕРЖАЩИЕ  АЛКАЛОИДЫ

 

 

I. Листья красавки (Folia Belladonnae) (ГФ XI, выпуск 2, ст. 13). Собранные в фазу начала бутонизации до массового плодоношения и высушенные листья многолетнего культивируемого растения красавки белладонны – Atropa belladonna, сем. паслёновых – Solanaceae.

1. Внешние признаки. Цельное сырьё. Цельные или частично измельчённые листья эллиптической, яйцевидной или продолговато-яйцевидной формы, к верхушке заострённые, цельнокрайние, к основанию суживающиеся в короткий черешок, тонкие, длиной до 20 см. и шириной до 10 см.

Цвет листьев сверху зелёный или буровато-зелёный, снизу – более светлый. Запах слабый, своеобразный. Вкус не определяется.

Измельчённое сырьё. Кусочки  листьев различной формы, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Цвет зелёный или буровато-зелёный. Запах слабый, своеобразный. Вкус не определяется.

2. Микроскопия. При  рассмотрении листа с поверхности  видны клетки эпидермиса с  извилистыми боковыми стенками  и складчатой кутикулой. Устьица  многочисленные, окружены 3-4 околоустьичными  клетками, из которых одна значительно меньше других (анизоцитный тип), преобладают на нижней стороне листа. Волоски редкие, головчатые и простые. Головчатые волоски двух типов: с длинной многоклеточной ножкой и одноклеточной головкой, с одноклеточной ножкой и многоклеточной (из 4-6 клеток) головкой. Простые волоски 2-3- (реже 6-)-клеточные, с тонкими стенками. В губчатой паренхиме видны овальные клетки, заполненные мелким кристаллическим песком оксалата кальция. При малом увеличении они имеют вид тёмных, почти чёрных пятен, при большом – сероватые с различимой кристаллической зернистостью. Очень редко в центре клетки с кристаллическим песком можно различить друзы или призматические кристаллы оксалата кальция.

3. Числовые показатели. Цельное сырьё. Суммы алкалоидов  в пересчёте на гиосциамин не менее 0,3%; влажность не более 13%; золы общей не более 15%; золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, не более 3%; пожелтевших, побуревших и почерневших листьев не более 4%; других частей растения (стеблей, цветков, плодов) не более 4%; измельчённых частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм., не более 4%; органической примеси не более 0,5%; минеральной примеси не более 0,5%.