Фитохимический анализ алкалоидов

б) Извлечение алкалоидов из растительного сырья, полученное экстракцией 1-2%-ным раствором кислоты, подщелачивают и после этого  основания алкалоидов извлекают  органическим растворителем. Если алкалоиды извлекали спиртом (этиловый, метиловый), то спирт отгоняют, а полученный остаток растворяют в воде. При этом соли алкалоидов растворятся в воде, а та часть сопутствующих веществ, которая в воде не растворилась, отделяется фильтрованием. Водный раствор солей алкалоидов подвергают дальнейшеё очистке, как было уже указано.

2) Очистка извлечений хроматографическим методом (на колонке). Адсорбционная хроматография основана на избирательной адсорбции одного или нескольких веществ из растворов или из парогазообразной смеси твёрдыми веществами – сорбентами (адсорбентами). Хроматографический метод очистки и разделения алкалоидов применим как к водным растворам солей алкалоидов, так и к растворам оснований алкалоидов в органических растворителях. Адсорбционные процессы, применяемые в химико-фармацевтической промышленности, делят на две группы: 10 процессы очистки, при которых поглощаются примеси (сопутствующие вещества), а алкалоиды остаются в растворе; 2) процессы очистки, при которых поглощаются алкалоиды, а сопутствующие вещества остаются в растворе.

Различают два вида адсорбции: молекулярную и ионообменную. В первом случае происходит переход молекулы растворённого  вещества из подвижной фазы в неподвижную  – твёрдую. Адсорбция осуществляется на поверхности твёрдого сорбента без химической реакции.

Во втором случае происходит обмен  ионов растворённого вещества с  ионами сорбента. Таким образом, ионообменная хроматография является методом, при  котором для очистки (разделения) используется процесс обмена ионов между растворённым веществом и ионообменными сорбентами. По природе ионообменные сорбенты делятся на минеральные и органические, а по характеру обмениваемых ионов – на аниониты и катиониты.

В качестве ионитов обычно используют ионообменные высокомолекулярные соединения – ионообменные смолы кислого или основного характера, нератсворимые в воде и органических растворителях. Полученные извлечения пропускают через колонку, заполненную сорбентом. Сорбент и условия адсорбции должны быть  выбраны такие, чтобы адсорбция извлекаемого вещества (или веществ) была избирательной и максимальной. Десорбция (элюирование) алкалоидов проводится подходящим растворителем, обеспечивающим максимальное элюирование.

3. Разделение суммы алкалоидов. В растительном сырье обычно содержится не один, а несколько алкалоидов, и в большинстве случаев при обработке растительного сырья в извлечение переходят все или большинство алкалоидов (сумма). Отделить один «нужный» алкалоид от остальных, а тем более разделить сумму алкалоидов на индивидуальные соединения очень сложно. Так как большинство алкалоидов обладает различными физическими и химическими свойствами, предложить единую схему разделения трудно. Описано большое число методов и их различных модификаций, позволяющих разделить сумму алкалоидов на отдельные алкалоиды. Отметим только основные принципы разделения суммы алкалоидов.

1) Разделение суммы алкалоидов  на основании их различной  растворимости в органических  растворителях.

а) В некоторых случаях частичное  разделение происходит уже при обработке органическим растворителем первоначального водно-кислотного извлечения. При его обработке, например, этиловым эфиром, в органический растворитель могут перейти не все, а только часть алкалоидов. Оставшиеся в первоначальном растворе алкалоиды можно извлечь, используя для этого другие органические растворители (хлороформ, дихлорэтан и др.). Иногда таким способом можно достигнуть хороших результатов.

Но чаще у алкалоидов одного растения различие в растворимости бывает выражено не очень резко и поэтому достигается только частичное разделение. В таких случаях требуется или повторное проведение этой операции, или применение другого способа разделения.

б) При последовательной обработке  остатка (суммы алкалоидов), полученного  после отгонки растворителя, различными органическими растворителями (петролейный эфир, бензол, хлороформ и др.) в некоторых случаях можно достигнуть частичного разделения суммы алкалоидов.

2) Разделение суммы алкалоидов  по различной силе основности.

а) Если к водному раствору суммы солей алкалоидов с различно выраженными основными свойствами прибавить щёлочь в недостаточном количестве для переведения всех солей алкалоидов в основания, то в первую очередь в реакцию вступят соли алкалоидов со слабо выраженными основными свойствами, а более сильные основания останутся в виде солей. При обработке такого раствора органическим растворителем образовавшиеся свободные основания алкалоидов перейдут в органический растворитель, а соли более сильных оснований алкалоидов останутся в водном слое. После этого к водному раствору вторично добавляют определённое (недостаточное) количество щёлочи и затем этот раствор вновь обрабатывают органическим растворителем. Вытесненные из солей более сильные основания алкалоидов перейдут в новую порцию органического растворителя. К оставшемуся водному слою ещё добавляют щёлочь и т. д. до полного переведения солей алкалоидов в свободные основания.

Таким образом, более слабые основания  алкалоидов будут в первых фракциях органического растворителя, а более сильные – в последних.

б) Если к раствору суммы  свободных оснований алкалоидов в органическом растворителе прибавить недостаточное количество кислоты, то в первую очередь в реакцию с кислотой вступят алкалоиды с сильно выраженными основными свойствами, тогда как более слабые основания останутся в свободном состоянии. Таким образом, при подобном извлечении алкалоидов из растворов в органическом растворителе небольшими порциями кислоты, так же как и при дробном подщелачивании, можно получить ряд фракций, в которых алкалоиды распределяются по «силе основности» - в первых фракциях будут находиться сильные основания алкалоидов, в последующих – более слабые.

Разделение по этому принципу не бывает полным и требует повторной обработки обогащённых фракций.

3) Разделение суммы алкалоидов путём получения солей или других производных. Этот метод основан на том, что в некоторых случаях при обработке суммы алкалоидов каким-либо реактивом в реакцию вступают не все алкалоиды смеси, а часть или один из алкалоидов. Например, так можно разделить фенольные и нефенольные алкалоиды (эметин и цефаэлин). Можно разделить довольно сложную смесь алкалоидов путём получения различных солей алкалоидов (гидрохлориды, гидробромиды, оксалаты, иодиды, пикраты и др.) и дальнейшей перекристаллизацией их.

4) Разделение суммы  алкалоидов хроматографическим  методом. Этот метод используется  как для очистки, так и разделения  алкалоидов. Разделение алкалоидов  основано на том, что они  обычно имеют различную адсорбционную  способность. Например, хроматографическим методом из сложной смеси алкалоидов мака можно выделить морфин, из суммы алкалоидов эфедры – эфедрин.

Через колонку, заполненную  соответствующим сорбентом, пропускают раствор или извлечение, содержащее несколько алкалоидов. Десорбцию (элюирование) проводят подходящим растворителем или смесью растворителей. При этом получают несколько фракций, содержащих индивидуальные алкалоиды или менее сложную смесь алкалоидов. Если необходимо, отдельные фракции подвергают повторному хроматографированию.

5) Разделение суммы  алкалоидов по различной температуре кипения. В случае присутствия в смеси летучих алкалоидов разделить их можно путём фракционной перегонки. Так, например, конин и конгидрин (алкалоиды болиголова пятнистого) сильно отличаются по температуре кипения. Перегонку обычно проводят при пониженном давлении.

3.2. Качественное  определение и идентификация

Для обнаружения алкалоидов в растительном сырье чаще всего  используют общие (осадочные) реакции  и хроматографию. Кроме того, учитывают  ещё некоторые свойства алкалоидов: их растворимость в кислотах и выпадение в осадок после подщелачивания, щелочную реакцию спиртовых растворов оснований алкалоидов и др. С целью идентификации алкалоидов проводят специфические (цветные) реакции, микрокристаллоскопические реакции и хроматографический, спектрскопический, люминесцентный анализы и т. д.

1. Общие реакции на  алкалоиды (реакции осаждения). Реакции  осаждения позволяют установить  наличие алкалоидов даже при  незначительном их содержании. Основаны  на том, что алкалоиды при взаимодействии с некоторыми веществами образуют нерастворимые в воде соединения. Это главным образом соли тяжёлых металлов, комплексные иодиды, комплексные кислоты и некоторые органические соединения кислотного характера. Для проведения качественных реакций из растительного сырья обычно готовят кислотное извлечение. При добавлении соответствующих реактивов в присутствии алкалоидов тотчас или через некоторое время образуется осадок. Обилие осадка зависит как от количественного содержания алкалоидов, так и от чувствительности их к реактиву. Однако следует учитывать, что с общими реактивами образуют осадки ещё и некоторые другие органические соединения, которые могут содержаться в неочищенных извлечениях (холин, бетаин, белки, продукты их разложения и др.). Поэтому, чтобы получить более достоверные результаты, общие реакции проводят ещё и с очищенными извлечениями.

Ввиду того, что чувствительность различных алкалоидов к «осадочным реактивам» неодинакова, реакции обычно проводят не с одним каким-либо реактивом, а с несколькими (5-7) различными реактивами. Наиболее часто используются следующие реактивы: Майера (раствор дихлорида ртути в иодиде калия – K₂[HgI₄]), Вагнера и Бушарда (раствор иода в иодиде калия – K[I₃]), Драгендорфа (раствор иодида висмута в иодиде калия – K[BiI₄]), Марме (раствор иодида кадмия в иодиде калия – K₂[CdI₄]),раствор танина, растворы кремнефольфрамовой (SiO₂*12WO₃*2H₂O), фосфорномолибденовой (H₃PO₄*12MoO₃*2H₂O), пикриновой кислот и др.

2. Специфические реакции  на алкалоиды. Если необходимо установить присутствие определённого алкалоида или определённой группы алкалоидов в растительном сырье, проводят специфические реакции (цветные) и микрокристаллоскопические реакции.

Специфические реакции проводят с индивидуальными алкалоидами или с очищенной суммой алкалоидов.

Алкалоиды из растительного  сырья извлекают 1-5%-ным раствором  какой-либо кислоты (соляная, серная или  другая). Кислотное извлечение подщелачивают  раствором аммиака или другой щёлочи и затем алкалоиды извлекают органическими растворителями (хлороформом, дихлорэтаном, этиловым эфиром и т. д.). Органический растворитель отгоняют или выпаривают в фарфоровой чашке и с остатком проводят соответствующие реакции. В качестве специфических реактивов на алкалоиды при проведении реакций окрашивания довольно часто используют концентрированную H₂SO₄ и HNO₃, а также концентрированную H₂SO₄, содержащую формалин (реактив Марки), концентрированную H₂SO₄ с молибдатом аммония (реактив Фреде) и др. При проведении микрокристаллоскопических реакций – пикриновую, пикролоновую, и стифниновую кислоты, роданидные и иодидные комплексы металлов и др.

3. Хроматографический  анализ. Хроматография на бумаге  и в тонком слое сорбента  является ведущим аналитическим  методом в фитохимическром анализе.

При проведении фитохимического анализа вообще и, в частности, анализа растительного сырья, содержащего алкалоиды, эти методы могут быть использованы как для обнаружения и идентификации алкалоидов, так и для контроля степени очистки и разделения суммы алкалоидов.

1) Хроматография на бумаге. Существует большое число различных методов «бумажной хроматографии» (БХ). Наиболее простыми и часто применяемыми являются методы восходящей, нисходящей и радиальной хроматографии. При восходящей и нисходящей хроматографии на стартовую линию полосы хроматографической бумаги наносят капилляром или специальной пипеткой исследуемое извлечение и раствор «свидетеля». Объёмы испытуемого извлечения и раствора «свидетеля», наносимые на хроматограмму, зависят от концентрации извлечения и раствора, а также чувствительности алкалоидов к реактиву.

Способ закрепления  подготовленной хроматограммы в  хроматографической камере зависит  от метода хроматографирования. Система растворителей должна обеспечивать максимальное разделение алкалоидов, содержащихся в извлечении. При соприкосновении хроматограммы с жидкостью растворитель начинает медленно распространяться вдоль бумаги. Когда растворитель проходит через участок, где нанесена сумма алкалоидов, происходит растворение веществ, и они перемещаются вместе с жидкостью. На каждом участке хроматограммы происходит многократное перераспределение вещества между подвижной и неподвижной фазой, и поэтому скорость перемещения веществ по бумаге различна и зависит от его коэффициента распределения. Расстояние между стартовой линией и фронтом растворителя может быть различным (20-40 см.) и зависит от разницы между R_f веществ, содержащихся в извлечении. Чем меньше разница между R_f, тем больше должно быть расстояние от стартовой линии до фронта растворителя. Экспозиция обычно от 3 до 20 ч., что определяется маркой хроматографической бумаги, системой растворителей и др. Чаще всего используются следующие системы растворителей: 1) н-бутанол – уксусная кислота – вода (5:1:4); 2) н-бутанол – уксусная кислота – вода (10:2:5);3) н-бутанол – соляная кислота – вода (100:4: вода до насыщения); 4) этилацетат – уксусная кислота – вода (11:21:85); 5) н-бутанол – пиридин – вода (10:2:5) и др.

Для обнаружения алкалоидов высушенную хроматограмму обрабатывают каким-либо реактивом, дающим с алкалоидами окрашены соединения. Чаще всего для этого используют реактив Драгендорфа. При обработке хроматограммы этим реактивом появляются оранжевые или оранжево-красные пятна (алкалоиды) на жёлтом фоне. Можно для обнаружения алкалоидов использовать пары иода (образуются бурые пятна). Для обнаружения стероидных алкалоидов можно использовать насыщенный хлороформный раствор трёххлористой сурьмы с последующим нагреванием при 105⁰С. Появляется кирпично-красное окрашивание.

2) Хроматография в  тонком слое сорбента. Тонкослойная хроматография (ТСХ) может быть использована для идентификации и при количественном определении алкалоидов в растительном сырье. Хроматографирование проводят на пластинках с закреплённым и незакреплённым слоем сорбента. В качестве сорбента используют «оксид алюминия для тонкослойной хроматографии», силикагель марки КСК и др.

Для приготовления пластинок  с закреплённым слоем сорбента в  качестве фиксатора применяют CaSO₄*1/2H₂O; основой служат стеклянные пластинки размером 12-20*8-15 см.

Извлечение и раствор «свидетеля» наносят капилляром или специальной пипеткой на стартовую линию, которая отстоит от нижнего края пластинки на 1,5-2 см. Для разделения обычно применяют способ восходящей хроматографии. Край пластинки погружают в жидкость, которую наливают в хроматографическую камеру. Слой жидкости должен быть около 5 мм. Пластинку с закреплённым слоем помещают в хроматографическую камеру, насыщенную парами растворителя, вертикально, с незакреплённым слоем – под углом 15-20⁰. Экспозиция от 30 мин. до 1, 5 ч.