Конъюгативный перенос плазмид биодеградации

 

На основе результатов  полученной антибиотикограммы возможны следующие скрещивания:

• BS1393 – реципиент; доноры: NF142 (p142NF), BS394 (pBS262), BS394 (pBS268), BS3701 (pBS1141), BS57 (pBS57).
• BS394 – реципиент; доноры: BS1393 (pBS216), NF142 (p142NF), BS3701(pBS1141), BS57 (pBS57).
• KT 2442 – реципиент; доноры: BS394 (pBS268), BS1393 (pBS216), NF142 (p142NF), BS3701(pBS1141), BS57 (pBS57).

Из всех возможных скрещиваний  были выбраны:

1-ое скрещивание: BS 1393 × NF142 (p142NF);

2-ое скрещивание: BS 1393 × BS3701 (pBS1141).

В результате скрещивания  получили два трансконъюгантных  штамма BS1393 (pNF142) и BS1393 (pBS1141).

Для отбора трансконъюгантов от донорных и реципиентных штаммов, колонии клеток высевали на среду Е с добавлением на крышку чашки Петри нафталина и соответствующего антибиотика.

3.2. Скрещивание.

Одной из характеристик трансконъюгантных  плазмид является частота переноса (отношение количества трансконъюгантов к количеству донора), которая для  каждого скрещивания различна и  может колебаться от 10^-10 до 1. Поэтому для двух скрещиваний проведенных в этой работе определили частоту переноса.

Частота переноса плазмиды.

Число колоний трансконъюгантов 1-го скрещивания в 1 мл:  48000 шт.

Число колоний донора NF142 (p142NF): 10⁷

Частота 1-го скрещивания: ν =  4,8 х 10⁴ / 6 х 10⁷ = 0,8 х 10^-3

Число колоний трансконъюгантов 2-го скрещивания в 1 мл: 390 шт.

Число колоний донора BS3701 (pBS1141): 10⁷

Частота 2-го скрещивания: ν = 3,9 х 10² / 4*10⁷ = 0,98 х 10^-5

Таким образом, перенос плазмид  биодеградации нафталина p142NF в реципиентный штамм BS 1393 проходи с частотой 10^-3, а плазмиды pBS1141 с частотой 10^-5. Данные частоты переноса плазмид не очень высокие, однако некоторые плазмиды биодеградации переносятся с гораздо меньшей частотой (10^-7 - 10^-8), что происходит вероятно из-за большого размера этих плазмид. 

 

3.3. Проверка трансконъюгантов.

Трансконъюганты полученные в результате скрещивания должны проявлять фенотип реципиентного штамма и использовать нафталин в качестве источника углерода.

Реципиентный штамм BS1393 является продуцентом феназинов (феназин – это слабое основание; представляет собой кристаллы желтого цвета; плохо растворяется в воде, однако летуч с водяным паром; производные феназина обладают антибиотической активностью). При росте на богатой среде штамм BS1393 выделяет феназины оранжевого цвета в культуральную среду.

Поэтому полученные трансконъюганты после нескольких пересевов на селективной среде (чтобы очистить от клеток донора и реципиента) пересеяли на среду LB. В результате роста трансконъюгант 1 выделял феназины в среду роста (рис. 3.1), а трансконъюгант 2 нет (рис. 3.2).

Кроме того, трансконъюганты  проверили на устойчивость к антибиотикам (таблица 3.2).

Таблица 3.2. Проверка трансконъюгантов на устойчивость к антибиотикам.

	Ар1000	Sm500	Km50	Tc20	Cef50	Rif50
1 скр	+	+	-	-	+	+
2скр	+	+	-	-	+	+
Донор NF142 (p142NF)	-	-	-	-	+-	-
Донор BS3701 (pBS1141)	-	-	-	-	+-	+
Реципиет BS 1393	+	+	-	-	+	+

 

На основе антибиотикограммы можно сделать вывод, что трансконъюганты проявляют устойчивость к тем же антибиотикам что и реципиентрый штамм.

 

                         

 

Рис.3.1. Рост трансконъюганта 1-ого скрещивания на богатой среде.

 

 

               

 

Рис.3.2.  Рост трансконъюганта 2-ого скрещивания на богатой среде.

 

Таким образом, полученный в  первом скрещивании трансконъюгант растет на нафталине и проявляет  фенотип реципиента (устойчивость к  антибиотикам и продукция феназинов), что говорит о переносе плазмиды биодеградации нафталина в реципиентный штамм. Трансконъюганты полученные в результате второго скрещивания  проявляют устойчивость к тем  же антибиотикам, что и реципиетный  штамм однако продукция феназинов  у данных трансконъюгантов не наблюдается. Для точного подтверждения переноса плазмид необходимо в дальнейшем провести выделение плазмид из полученных трансконъюгантов.

 

 

 

 

 

Выводы.

 1. Составлена антибиотикограмма для исследуемых штаммов.    На основе результатов полученной антибиотикограммы была выбрана концентрация антибиотика (Sm₅₀₀) для создания селективной среды.

2. Проведено скрещивание и получены трансконъюганты BS1393 (pNF142) и BS1393 (pBS1141). Определена частота переноса плазмид:   плазмиды pNF142 в реципиентный штамм BS1393 составила 10^-3; а плазмиды pBS1141 - 10^-5.

3. Проверены трансконъюганты на устойчивость к антибиотикам и на способность синтезировать феназины, что подтверждает перенос плазмид.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы.

1. Основы ксенобиологии:  Учеб. пособие/В.М. Юрин.-Мн.: БГУ, 2001. 234 с.

2. Рыбчин В.Н. Основы  генетической инженерии. 2 изд., перераб.  и доп.: Учебник для ВУЗов. СПб.: Изд-во СПбГТУ, 2002. 522 с.

3. Учебно-методическое пособие  по курсу «Генетические методы  биотехнологии защиты окружающей  среды». Авторы: к.б.н. Пунтус Ирина Филипповна, к.б.н. Ахметов Ленар Имаметдинович, к.б.н. Филонов Андрей Евгеньевич.

4. Доналдсон Н. Химия и технология соединений нафталинового ряда. 1963. М.: Наука. с.655.

5. Балашова Н.И., Кошелева И.А., Филонов А.Е., Гаязов Р.Р., Боронин А.М. 1997.  Штамм Pseudomonas putida BS3701 – деструктор фенантрена и нафталина // Микробиология. Т. 4.