Конъюгативный перенос плазмид биодеградации

Третий  тип переноса — конъюгация — это процесс, при котором клетки бактериального штамма-донора вступают в непосредственный механический контакт с клетками реципиентного штамма и передают последнему генетический материал. Реципиент, который получает этот материал, называется трансконъюгантом.

 

1.3.4. Конъюгация.

По  способности к конъюгационному  переносу плазмиды делят на конъюгативные  и неконъюгативные.

 Неконъюгативные  плазмиды не содержат детерминантов,  придающих бактериальным клеткам  свойства генетических доноров,  и поэтому они не способны  самостоятельно передаваться от  одних клеток к другим. Однако  такие плазмиды могут быть  перенесены в реципиентные клетки  с помощью конъюгативных плазмид.  Перенос неконъюгативных плазмид  конъюгативными называется мобилизацией.

Конъюгация  открывает широкие возможности  для генетического анализа и  конструирования штаммов бактерий. Время вхождения генетических маркеров донора в реципиентную клетку отражает их локализацию на хромосоме. Этот принцип  используется для картирования генов  в опытах с прерыванием конъюгации. Построение генетических карт облегчает генетическое конструирование микроорганизмов и изучение регуляции различных клеточных процессов.

Конъюгация  все чаще применяется при конструировании  промышленных штаммов микроорганизмов. Используя этот метод, можно легко  получать генетические рекомбинанты, проводить мобилизацию неконъюгативных  плазмид, создавать гибридные (коинтегративные) плазмиды, объединять различные плазмиды в одной клетке. [3]

Ярким примером создания микроорганизма с  помощью переноса природных плазмид  служит получение штамма P. putida, способного утилизировать большинство основных углеводородов нефти. Многие псевдомонады несут плазмиды, каждая из которых  кодирует ферменты, необходимые для  расщепления одного-единственного  класса углеводородов. Плазмида ОСТ  обусловливает расщепление октана, гексана и декана, плазмиды XYL —  ксилола и толуола, САМ — камфоры, NAH — нафталина. Две из них плазмид, САМ и NAH, являются конъюгативными, а  две другие из этих плазмид, ОСТ и XYL, мобилизуются указанными плазмидами. В результате последовательных скрещиваний  был получен штамм P. putida, несущий  плазмиды XYL и NAH и гибридную плазмиду, вероятно, коинтеграт, содержащий плазмиды ОСТ и САМ. Такая мультиплазмидная бактерия энергично растет, усваивая неочищенную нефть, поскольку она  утилизирует гораздо больше углеводородов, чем любая бактерия с одной  плазмидой.

За  конъюгативные свойства плазмид отвечает оперон tra, содержащий более 25 генов. Гены tra определяют и (или) контролируют: 1) образование отростков, называемых донорскими половыми ворсинками, которые обязательны (по крайней мере для большинства конъюгативных плазмид) для осуществления донорными клетками контакта с клетками реципиента;

2) вещества, снижающие частоту конъюгации   (спаривания)   донора   с  донором;

3) конъюгационный  перенос плазмидной или хромосомной ДНК, начинающийся с определенного места (точка начала переноса) в молекуле конъюгативной плазмиды.

Структурными  компонентами, обеспечивающими интеграцию F-плазмиды в бактериальную хромосому, являются элементы IS2, IS3a, IS3b, входящие в состав плазмидной ДНК. Они взаимодействуют с аналогичными элементами бактериальной ДНК через сайт-специфическую или RecA-зависимую рекомбинацию и встраиваются в нее в разных местах и направлениях в зависимости от локализации и направления бактериальных элементов. Клетка после интеграции в ее хромосому F-плазмиды способна с высокой частотой ориентированно передавать свои гены в реципиенты. Это пример генной инженерии in vivo, осуществляющийся в природе с помощью плазмид.

В конъюгативных  плазмидах могут   также  находиться гены, отвечающие за другие фенотипические признаки, такие, как устойчивость к  антибиотикам, устойчивость к ионам  тяжелых металлов, продукция бактериоцинов, поверхностных антигенов и энтеротоксинов.   Конъюгативные плазмиды имеются, по-видимому, у всех грамотрицательных бактерий; не так давно они были обнаружены у некоторых видов Streptomyces и Streptococcus.

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 2. Материалы  и методы.

2.1. Штаммы.

В исследованиях использовали бактериальные штаммы (таблица 2.1.)

 

Штамм	Характеристика	Плазмиды	Размер (тпн)	Источник
P.putida BS3701	Nah+Sal+Gen+ Phn+Hna+Tra+	pBS1141, IncP-9β pBS1142	100   60	Коллекция лаборатории, изолирован из образцов почв г.Видное, Московской области
P.putida BS393	Nah+Sal+ Phn+Hna+Cys-Tra+	pBS216, IncP-9δ	83	Коллекция лаборатории, Металлургический завод, г.Магнитогорск
P.putida 142NF	Nah+Sal+ Tra+	p142NF, IncP-9δ	100	Завод «Метоксил» Нижегородской  области
P.putida BS394	Nah-Sal-Cys- NalRSmR	-	-	Коллекция лаборатории
P.putida KT2442	Nah-Sal-gfpKmR	-	-	К.Смалла(Германия)
P.aureofaciens BS1393	Продуцент феназиновых антибиотиков	-	-	ЛБП, ИБФМ РАН
Pseudomonas putida BS394	Cap+Cys-RifRSmR	pBS268 IncP-9	100	B.J.J.Lugtenberg (Лейден, Голландия)
Pseudomonas putida BS394	Cap+Cys-RifRSmR	pBS262 IncP-2	450	B.J.J.Lugtenberg (Лейден, Голландия)
Achromobacter sp.BS57	Cap+	pBS57	более 100	С территории производственного  объединения «Азот», г.Щекино, Тульская область

Phn⁺ - способность к росту на фенантрене; Nah⁺ - способность к росту на нафталине; Sal⁺ - способность к росту на салицилате; Gen⁺ - способность к росту на гентамицине; Hna⁺ - способность к росту на нафтоле;  Сys^- - ауксотрофность по цистеину; Cap⁺ - способность к росту на капролактаме; Km^R – способность расти на канамицине; Sm^{R –} способность расти на стрептомицине; Rif^R – способность расти на рифампицине; Inc P9- группа несовместимости; gfp – способность к флуорисценции; Tra⁺ - конъюгативность.

 

2.1.1. Культивирование микроорганизмов

Для культивирования микроорганизмов  использовали богатую среду LB и минеральную  среду Е с добавлением нафталина (на крышку чашки Петри или в жидкую среду) и цистеина до конечной концентрации 0,005% (для ауксотрофного штамма Pseudomonasputida BS394). Культивирование на жидких средах проводили при 28⁰С, 200 об/мин; на твердой среде – в термостате при 27⁰С.

Среда LB: 10 г бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, воды дистиллированной до 1 л, pH 7,5.

Среда Е: 8,71 г K₂HPO₄, 1 л дистиллированной воды, рН 7, по 1 мл: 5М р-р NH₄Cl,  0,1 M p-p Na₂SO₄, 62 mM p-p MgCl₂, 1 mM p-p CaCl₂, 0,005 mM p-p (NH₄)₆MoO₂₄×4H₂O, микроэлементы (10 ml HCl + 990 ml H₂O_дист + 0,41г ZnO + 5,4 г FeCl₃×6 H₂O + 2,00 г MnCl₂×4H₂O + 0,17 г CuCl×2H₂O + 0,48 г CoCl₂×6H₂O + 0,06 г H₃BO₃).

2.1.2. Антибиотикограмма.

Для проверки бактерий на чувствительность к антибиотикам выбрали ампицилин (Ap), канамицин (Km), стрептомицин (Sm), гентамицин (Gm), тетрациклин (Тс), рифампицин (Rif), цефотаксим в концентрациях приведенных в таблице 2.2.

Методика антибиотикограммы  достаточно специфична и позволяет выявить спектр чувствительности каждого из членов бактериального сообщества. В пробирки с 5 мл стерильной питательной средой LB засевают штаммы бактерий. Инокулят растят сутки при температуре 27⁰С. В пробирки с 5 мл свежей среды и разными концентрациями антибиотиков засевают инокулят. Растят сутки при аэрации и температуре 27⁰С. На следующий день смотрят результаты.

Таблица 2.2. Концентрация антибиотиков.

Нужная концентрация			Сток, мг/мл
Ар1000	Ар500	Ар20	Ар 100
Km500	Km100	Km50	Km 250
Sm500	Sm100	Sm50	Sm 100
Gm100	Gm50	Gm20	Gm 40
Tc100	Tc50	Tc20	Tc 100
Rif500	Rif100	Rif50	Rif 5
Cef100	Cef50	Cef20	Cef 250

 

2.2. Конъюгация.

1. Для скрещивания были выбраны штаммы бактерий:

Реципиент:  P.aureofaciens BS1393.

Доноры: P.putida 142NF(p142NF); P.putida BS3701 (pBS1141).

2. Перенос плазмид биодеградации нафталина в реципиентные штаммы в процессе конъюгации.

1-й  день

1. Вырастить свежие ночные  культуры донорного - Pseudomonas putida BS 3701 (pBS1141) и Pseudomonas putida 142NF(p142NF) и реципиентного - Pseudomonas aureofaciens BS 1393 штаммов.

2-й  день

1. Донор и реципиент  пересеять и растить до мутности 10⁸ КОЕ/мл:  100 мкл в 5 мл LB;

2. Провести скрещивание:  для этого на чашку с твердой агаризованныой средой LB в одну каплю наносят 100 мкл донора и 200 мкл реципиента;

3. Скрещивание оставить на ночь при 28⁰С.

3-й  день

1. Смывают скрещивание  с чашек 500 мкл физ. раствора (0,85 г NaCl на 100 мл воды);

2. 100 мкл суспензии высевают на чашку Петри, содержащую селективную среду для отбора трансконъюгантных штаммов. Нафталин вносится на крышку чашки Петри. Трансконъюганты растить в течении 2-10 дней до образования четких колоний.  

Рассчитывают частоту  скрещивания (количество выросших  трансконъюгантов на клетку донора).

Для расчета частоты скрещивания считают выросшие колонии трансконъюгантов и использовали формулу:

ν =

n – число трансконъюгантов;

N – число доноров.

Высевают контроли для проверки роста реципиента и доноров на селективной среде: Pseudomonas aureofaciens BS 1393, Pseudomonas putida 142NF(p142NF), Pseudomonas putida BS 3701 (pBS1141) на чашку с селективной средой, антибиотиком, нафталином.

 

 

 

 

 

Глава 3. Результаты и обсуждение.

Полициклические ароматические  углеводороды (ПАУ) загрязняют окружающую среду. Известно, что штаммы бактерий способны использовать ПАУ и др. ксенобиотики как источники углерода и энергии. За способность утилизировать  ПАУ часто отвечают плазмиды биодеградации, кодирующие ферменты участвующие в  деградации этих соединений.

Природные штаммы часто  трудно культивировать и перенос  плазмид из этих штаммов в новые  штаммы с известными свойствами является одним из способов решения этой проблемы. Кроме того, различные плазмиды придают  одному и тому же штамму-хозяину  различные свойства, так две разные плазмиды деградации нафталина могут  по-разному влиять на ростовые характеристики одного штамма. Например, были изучено  влияние плазмид деградации капролактама на параметры роста штамма P. putida BS394 (рис. 3.1). Из рисунка видно, что штамм с различными плазмидами по-разному растет на капролактаме (различная продолжительность лаг-фазы, скорости роста).

Таким образом, получение  штамма с разными плазмидами представляет интерес для дальнейшего изучения влияния этих плазмид на физиологические  и биохимические характеристики бактеии-хозяина.

В данной работе использовали несколько бесплазмидных штаммов (реципиентов) и донорных штаммов, несущих  плазмиды биодеградации нафталина или капролактама (таблица 2.1). Методом культивирования на минимальной среде Е с добавлением нафталина и капролактама в качестве единственного источника углерода и энергии установили, что бесплазмидные штаммы не способны к росту на этих субстратах, в то время как донорные штаммы хорошо росли на одном из них.

 

Рис. 3.1 Динамика роста штамма P. putida BS394, содержащего различные cap-плазмиды, на капролактаме (1,5 г/л): □-pBS268, ○-pBS276, ∆-pBS266 [Есикова Т.З. Плазмиды биодеградации ε-капролактама бактерий рода Pseudomonas: Дисс. канд. биол. наук. Пущино. 1990. 133 с.]

3.1 Антибиотикограмма

В результате скрещивания  на неселективной среде в конъюгативной  смеси кроме трансконъюгантов присутствуют как доноры, так и реципиенты.

Для того чтобы отобрать трансконъюганты от донорных и реципиентных штаммов необходимо создать условия, при которых растет только трансконъюгант. Как было установлено реципиентные штаммы не растут на используемых субстратах (капролактам и нафталин). Поэтому  для отбора трасконъюгантов от реципиетнов  смесь клеток после скрещивания  высевали на минеральную среду Е  с добавлением ксенобиотиков  в качестве источника углерода. Донорные штаммы способны использовать ксенобиотики в качестве источника углерода и  энергии. Таким образом, для отбора трасконъюгантов от донора необходимо создать условия, в которых донорные клетки не способны к росту, например, добавление в среду культивирования антибиотиков к которым донор будет чувствителен. Однако, при добавлении в селективную среду антибиотика необходимо чтобы реципиетнт был устойчив к этим антибиотикам. Для этого получили антибиотикограмму штаммов бактерий (таблица 3.2).

 

Таблица 3.2. Проверка штаммов бактерий на устойчивость к антибиотикам методом антибиотикограммы.

Ант-к        Штамм	Ампициллин			Канамицин			Стрептомицин			Гентамицин			Тетрациклин			Рифампицин			Цефотаксим
	1000	500	20	500	100	50	500	100	50	100	50	20	100	50	20	500	100	50	100	50	20
BS394 pBS262	+-	+	++	-	-	-	++	++	++	-	-	-	-	-	-	-	+-	+-	+-	+-	+-
BS1393 pBS216	++	++	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+-	+-	+-
142NF p142NF	-	+	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+-	+-	+-
BS1393	+	+	+	-	+-	+-	+	++	++	-	-	-	-	-	+-	-	+	+	+	+	++
BS3701 pBS1141	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+-	+-	+-
BS57 pBS57	+	+	++	-	-	-	-	++	+	+-	+-	+-	-	-	-	+-	+	+	+	+	+
BS394 pBS268	+-	+	+	-	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+-	+-	++
BS394	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+-	+-
KT 2442	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+