Конъюгативный перенос плазмид биодеградации

Министерство образования и  науки

Федеральное государственное бюджетное  образовательное

учреждение высшего профессионального  образования

 

Кафедра Биотехнологии

 

 

Курсовая работа по дисциплине

«Общая биотехнология»

Конъюгативный перенос  плазмид биодеградации.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2012.

Содержание.

Введение…………………………………………………………………………..……………...3

Глава 1. Литературный обзор…………………………………………………………………...4

1.1. Ксенобиотики………………………………………………………..……………………4

1.1.1. Биологическая активность  ксенобиотиков…………………….……..….…………4

1.1.2. Биодеградация ксенобиотиков………………………………………………………5

1.2. ПАУ и их деструкторы………………………………………………………………...…7

1.2.1. ПАУ как загрязнители  окружающей среды………………………………………...7

1.2.2. Микроорганизмы-деструкторы ПАУ…………………………………………..……8

1.2.3. Биохимические пути  деградации нафталина……………………………………...10

1.2.4. Плазмиды биодеградации нафталина……………………………………………...11

1.3. Плазмиды бактерий. Конъюгация……………………………………………………...14

1.3.1. Плазмиды…………………………………………………………………………….14

1.3.2. Общие свойства бактериальных  плазмид…………………………………………15

1.3.3. Перенос генетической  информации между микроорганизмами…………………28

1.3.4. Конъюгация………………………………………………………………………….20

Глава 2. Материалы и методы…………………………………………………………………23

Глава 3. Результаты исследования…………………………………………………………….27

Выводы………………………………………………………………………………………….35

Список литературы…………………………………………………………………………......36

 

Введение.

В условиях постоянно возрастающих объемов промышленного и сельскохозяйственного  производства, все большую актуальность приобретают вопросы защиты окружающей среды и, в частности, атмосферы  от разнообразных техногенных загрязнителей. С развитием химической промышленности в биосферу стало поступать более  тысячи различных ксенобиотиков, которые  в значительной степени загрязняют окружающую среду. Известно, что соединения, вносимые человеком в окружающую среду в последнее время (пестициды, детергенты и другие ксенобиотики) помимо того, что очень токсичны, ещё и устойчивы в среде (что  представляет опасность для человека и животных). В настоящее время  нагрузка на естественные процессы самоочищения биосферы является избыточной, и параллельно  с деструкцией загрязнений идёт их постепенное накопление в окружающей среде. Деградация ксенобиотиков микроорганизмами имеет большое значение в защите биосферы.

Часто бактериальные гены катаболизма полициклических ароматических  углеводородов (ПАУ) расположены на плазмидах биодеградации вместе с регуляторными генами. Плазмиды биодеградации часто являются конъюгативными и способны к горизонтальному  переносу внутри и между бактериями родов в бактериальных популяциях, расширяя деградативный потенциал  микроорганизмов и способствуя  их адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды. Плазмиды переносят  из одного штамма в другой для создания новых штаммов-деструкторов нафталина.

Цель работы: провести конъюгативный  перенос плазмид биодеградации.

Для этого решались следующие  задачи:

1) составить антибиотикограмму  для используемых штаммов;

2) провести скрещивание  и определить частоту переноса;

3) подтвердить перенос  плазмид.

 

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Ксенобиотики.

1.1.1. Биологическая активность ксенобиотиков.

В силу различных причин многие химические вещества, поступающие  в организм и ранее не встречающиеся  в нем, получили название чужеродных, или ксенобиотиков. К таким веществам  относятся синтетические и природные  лекарственные препараты, пестициды, промышленные яды, отходы производств, пищевые добавки, косметические  средства и прочее.

Стремительные темпы развития промышленного производства, химизация  народного хозяйства ведут к  появлению во внешней среде большого количества разнообразных химических соединений, постоянно загрязняющих биосферу и пагубно влияющих на живую  природу. Поэтому утилизация токсических  отходов важна.

Организм - химическая «машина», причем многообразие химических соединений в организме обусловливает возможность его реакции практически с любым ксенобиотиком, попадающим в организм. Свойство живых систем быть реакционноспособным по отношению к любому ксенобиотику приводит к тому, что все химические соединения обладают биологической активностью. Организм в свою очередь не остается безучастным к появлению чужеродного химического соединения, которое независимо от его биологической активности либо используется для своих нужд, либо выводится из него, либо остается в организме чужеродным, что в последнем случае вызывает более глубокую физиологическую реакцию.

Принцип реакции живой материи  на ксенобиотик состоит в том, что попадание в организм даже одной молекулы вызывает его ответную реакцию; тип и величина реакции  определяются свойствами ксенобиотика, его концентрацией и биологической мишенью.

Биологической активностью ксенобиотика называют его способность изменять функциональные возможности либо компонентов организма (in vitro или in vivo), либо живого организма в целом, либо сообщества организмов. Такое определение биологической активности означает, что практически любое химическое соединение или композиция соединений обладает тем или иным видом биологической активности.

 

1.1.2. Биодеградация  ксенобиотиков

В удалении ксенобиотиков  из окружающей среды важны несколько  факторов:

• устойчивость ксенобиотиков к различным воздействиям;
• растворимость их в воде;
• летучесть ксенобиотиков;
• рН среды;
• способность ксенобиотиков поступать в клетки микроорганизмов;
• сходство ксенобиотиков и природных соединений, подвергающихся естественной биодеградации.

Для биодеградации ксенобиотиков  лучше использовать ассоциации микроорганизмов, так как они более эффективны, чем отдельно взятые виды. При этом типы связей в подобной ассоциации могут быть различны. Один вид микроорганизмов  может непосредственно участвовать  в разложении ксенобиотиков, а другой – поставлять недостающие питательные  вещества.

Преимущество бактериальной очистки  по сравнению с химической в том, что она не вызывает появления  нового загрязняющего агента в окружающей среде. Плотность фитопланктона  после бактериальной очистки  повышается. Некоторые микроорганизмы способны изменять молекулу ксенобиотика и делать ее доступной и привлекательной  для других микроорганизмов («кометаболизм»). Примером может служить разложение инсектицида паратиона под действием  двух штаммов Pseudomonas – P. aeruginosa и P. stuzeri. В некоторых случаях происходит неполное превращение молекулы ксенобиотика - фосфорилирование, метилирование, ацетилирование и т. д., результатом которого является утрата этим веществом токсичности. [1]

Наличие кислорода является необходимым требованием для  успешной аэробной биодеградации ПАУ. Доступность кислорода в почве  зависит от типа почв, сезонных колебаний  выпадения осадков, скорости потребления  кислорода микроорганизмами и других факторов. Микробная деградация ПАУ  в анаэробных условиях протекает  с очень низкими скоростями и  эффективность такой деградации в природных условиях пока остается не выясненной.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.2. Полициклические  ароматические углеводороды и  их деструкторы

1.2.1. Полициклические  ароматические углеводороды как  загрязнители окружающей среды

К полициклическим углеводородам  относятся соединения, которые содержат несколько бензольных колец, соединенных  вместе, при этом примыкающие кольца имеют общую пару атомов углерода (рис. 1.1).

Рис. 1.1. Полиароматические углеводороды

Устойчивость ПАУ к биодеградации  объясняется их низкой растворимостью в воде, которая снижается с  увеличением числа ароматических  колец, входящих в состав соединения.

Полициклические ароматические  углеводороды (ПАУ) загрязняют окружающую среду в результате сгорания некоторых  органических соединений при неполном доступе кислорода, особенно дерева и угля, работы коксо-, газо- и нефтехимических  производств, при аварийных разливах нефти и нефтепродуктов. В частности, в сточных водах и газовых  выбросах нефте-, газо- и коксохимических  производств содержится нафталин, фенантрен, антрацен, что представляет значительную опасность для живых организмов. Единственный представитель ПАУ, который используется в промышленности и производится в огромных масштабах (сотни тон в год) – это нафталин. ПАУ широко распространены в природе также вследствие лесных пожаров, вулканических процессов, а также в зонах нефтяных месторождений. [4]

Механизм образования  ПАУ в процессе сгорания - комплексный  процесс, происходящий в результате деполимеризации углеводородных фрагментов, которые формируются в результате крекинга больших молекул. Такой  процесс реполимеризации обычно происходит в условиях неполного  сгорания топлива; с уменьшением  концентрации кислорода увеличивается  содержание ПАУ.

Химическая структура и низкая растворимость соединений данного  класса в воде придает им повышенную устойчивость и является причиной аккумуляции  в различных экосистемах. ПАУ  токсичны для животных и человека. Многие из них, кроме того, обладают мутагенными и канцерогенными свойствами. Дибенз[a,h]антрацен и бензо[a]пирен  были первыми веществами, для которых  была экспериментально показана канцерогенная  активность. Сильным канцерогенным  действием обладают, кроме того, дибензпирены, а также синтетическое  нафтеноароматическое соединение –  холантрен.

 

1.2.2.Микроорганизмы - деструкторы ПАУ.

Известна способность  микроорганизмов, относящихся к  различным таксономическим группам, разлагать самые разнообразные  органические соединения. Процесс полного  или частичного разложения органических соединений популяцией микроорганизмов  с возможным использованием продуктов  разложения в качестве источников углерода и энергии принято называть микробиологической деградацией или биодеградацией.

Хотя некоторое уменьшение концентрации ПАУ в почве возможно за счет абиотических процессов, основную роль в деградации этих соединений играют микробные популяции. ПАУ  могут быть полностью деградированы  или частично трансформированы микробными сообществами. К настоящему времени  имеется достаточно сведений о выделении  микроорганизмов-деструкторов фенантрена, антрацена и другие ПАУ. Самые  разнообразные бактерии, относящиеся  к родам Pseudomonas, Aeromonas, Alcaligenes, Micrococcus, Beijerinckia, Nocardia, Vibrio, Flavobacterium способны к деградации ПАУ. [5]

Особенно трудно разлагаются такие  биоциды, как детергенты, пластики и  углеводороды. Самыми способными к  борьбе с загрязнителями различного типа являются представители рода Pseudomonas – они практически «всеядны». Клетки этих микроорганизмов содержат оксидоредуктазы и гидроксилазы, способные разлагать большое  число молекул углеводородов  и ароматических соединений, таких  как бензол, ксилол, толуол. Гены, кодирующие эти ферменты, находятся в составе  плазмид. Например, плазмида OCT отвечает за разложение октана и гексана, XYL –  ксилола и толуола, NAH – нафталина, CAM – камфары. Плазмиды САМ и NAH обеспечивают собственный перенос, индуцируя  скрещивание бактериальных клеток; остальные плазмиды могут быть перенесены только в том случае, если в бактерии введены другие плазмиды, обеспечивающие скрещивание.

В 1979 г. Чакрабарти (в то время совместно  с компанией «Дженерал электрик») после успешных скрещиваний получил  штамм, содержащий плазмиды XYL и NAH, а  также гибридную плазмиду, полученную путем рекомбинации частей плазмид  САМ и ОСТ (сами по себе они несовместимы, т. е. не могут сосуществовать как  отдельные плазмиды в одной бактериальной  клетке). Этот штамм способен быстро расти на неочищенной нефти, так  как он метаболизирует углеводороды гораздо активнее, чем любой из штаммов, содержащих только одну плазмиду. Штамм может быть особенно полезен в очистных водоемах для сточных вод, где можно контролировать температуру и другие внешние факторы.

Эти микроорганизмы удобно использовать для очистки нефтяных пятен на суше или море при различных  авариях. Для большей эффективности  создают микроэмульсию, содержащую бактериальные штаммы и капсулы  со смесью основных питательных элементов - азота, фосфора и калия внутри. Добавление этих веществ стимулирует  размножение бактриальных штаммов. Применение такого метода позволяет  очистить от 70 до 90% загрязненной поверхности, за это же время очищается всего  порядка 10-20% необработанной поверхности.

 

1.2.3.Биохимические  пути деградации нафталина

Накоплен значительный экспериментальный материал, показывающий, что процесс биодеградации ПАУ  бактериями часто контролируются плазмидами, большинство из которых обнаружено у представителей рода Pseudomonas.