Конъюгативный перенос плазмид биодеградации

Пути деградации нафталина  у бактерий рода Pseudomonas (рис. 1.2) детально изучены.

Расщепление нафталина  происходит через образование салициловой  кислоты, которая окисляется далее  через катехол. Катехол расщепляется по двум альтернативным путям: 1) мета-пути – с образованием ацетальдегида  и пирувата или 2) орто-пути – с  образованием сукцината и ацетата.

Рис. 1.2. Биохимические пути деградации нафталина 

1.2.4.Плазмиды  биодеградации нафталина и их  структурно-генетическая организация

При окислении ароматических  соединений мета-путь расщепления катехола контролируется, как правило, плазмидными  генами, тогда как орто-путь –  хромосомными.

В 1973 году Данн в штамме P. putida G7 обнаружил плазмиду NAH, определяющую способность данного штамма к росту на нафталине и салицилате в качестве единственного источника углерода и энергии и кодирующую мета-путь расщепления катехола.

Позднее Даном были выделены еще две плазмиды биодеградации  нафталина pND140 и pND160. Обе плазмиды конъюгативны, принадлежат, подобно плазмиде NAH, к группе несовместимости Р9 и контролируют расщепление нафталина через салицилат, катехол и далее по мета-пути. Плазмиды pND140 и pND160 отличаются от плазмиды NAH тем, что кодируют белок катехол-2,3-диоксигеназу, имеющий оптимальное значение рH 7.2 в отличии от белка катехол-2,3-диоксигеназы, кодируемого плазмидой NAH (оптимум рH – 8.3).

В. В. Кочетковым  было охарактеризовано 13 плазмид биодеградации нафталина, обнаруженных в псевдомонадах, выделенных из образцов почвы, загрязненных продуктами коксохимических производств. Сравнительное  изучение свойств плазмид биодеградации  нафталина показало, что они отличаются между собой по размерам, по способности  к конъюгационному переносу и  несовместимости. Кроме того, было показано, что плазмиды детерминируют различные  пути катаболизма нафталина. Плазмиды pBS3, pBS211, pBS213, pBS215, pBS218, pBS219, pBS242 и pBS243 контролируют полное окисление нафталина через  салициловую кислоту с использованием мета - пути окисления катехола.

Структурные гены деградации нафталина объединены в два nah-оперона  и занимают область размером около 30 т.п.н. (Рис. 1.3). В результате инактивации nah1-оперона утрачивается способность к утилизации нафталина (Nah-Sal+ -фенотип), при инактивации nah2-оперона - к утилизации салицилата (Nah+Sal- - фенотип).

Первый оперон (nah1) включает гены nahABCDEF, кодирующие расщепление  нафталина до салицилата, а второй оперон (nah2) состоит из генов nahGHIJK, кодирующих ферменты окисления салицилата через  катехол и далее - по мета-пути до ацетальдегида и пирувата, которые  вступают в общий путь катаболизма.

 

Рис. 1.3. Схема организации  и регуляции экспрессии nah-генов  плазмиды NAH7. Ген nahR транскрибируется конститутивно. Продукт гена nahR - белок NahR, взаимодействуя с салицилатом, активирует оба nah-оперона. Стрелками указано  направление транскрипции

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.3. Плазмиды бактерий. Конъюгация.

1.3.1. Плазмиды.

Плазмиды представляют собой двухцепочечные кольцевые  молекулы внехромосомной  ДНК размером от 1 до 300 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.), стабильно наследуемые бактериальной  клеткой и способные к автономной репликации. В клетке может содержаться  несколько копий мелких плазмид (0,5-20,0 т.п.н.), в то время как крупных  плазмид в клетке обычно 1-2. Плазмиды различаются по детерминируемым  ими признакам, проявляемым бактериальными клетками-хозяевами. Выделяют плазмиды резистентности (R-плазмиды), несущие  гены устойчивости к лекарственным  препаратам, плазмиды биодеградации  ксенобиотиков (D-плазмиды), F-плазмиды или половые факторы, Ti-плазмиды (tumor-inducing), вызывающие образование опухолей у растений, Col-плазмиды, кодирующие синтез бактериоцинов, и другие. Плазмиды размером выше 20 т.п.н., как правило, имеют генетические системы, ответственные  за перенос плазмид в другие клетки в процессе конъюгации. Частота конъюгационного  переноса зависит от типа плазмиды и может составлять от 10^-8  до 1 образовавшихся трансконъюгантов на число клеток-доноров. Неконъюгативные плазмиды, тем не менее, могут быть мобилизованы для конъюгационного переноса конъюгативными плазмидами.

Иногда бактерии содержат несколько плазмид разной молекулярной массы. Некоторые же плазмиды не способны стабильно сосуществовать в одной  и той же клетке. Изучение несовместимости  плазмид разного происхождения  привело к распределению их на группы несовместимости – Inc-группы (incompatibility –несовместимость). К одной  группе несовместимости обычно относят  плазмиды, которые несовместимы между  собой, но совместимы с любой плазмидой  из других групп. Важнейшими компонентами плазмидного репликона являются детерминанты, регулирующие его репликацию, к которым относятся:

• Последовательность нуклеотидов, на которой происходит инициация репликации (oriV).
• Структурный ген (гены), контролирующий репликацию (rep).
• Генетические детерминанты, негативно контролирующие количество плазмидных копий (cop).
• Генетические детерминанты, обеспечивающие распределение плазмидных копий между дочерними клетками (par).

Репликация плазмид  в значительной степени зависит  от клетки-хозяина. Мутации, нарушающие репликацию бактериальной хромосомы, обычно влияют и на репликацию плазмид. Считается, что репликация плазмид, которые существуют в 1-4 копиях на клетку, подвержена строгому контролю. В то же время контроль репликаци многокопийных  плазмид является ослабленным, что  ведет к колебаниям количества копий.

 

1.3.2.Общие  свойства бактериальных плазмид.

Репликация. Основным свойством плазмид является способность к автономной репликации. Молекулы ДНК приобретают ее в том случае, если в них имеется сайт начала репликации — ori и, как правило, набор генов, необходимых для ее осуществления. Такие молекулы получили название репликонов. Хромосомы про-кариотических клеток содержат по одному ori-сайту, поэтому они относятся к монорепликонным системам. Плазмидные ДНК могут иметь по несколько ori-сайтов. Репликоны функционируют лишь тогда, когда в клетках есть все необходимые для этого ферменты. Клеточные хромосомы включают полный набор генов, кодирующих белки репликационного комплекса. Внехромосомные же генетические элементы содержат не все необходимые для этого гены, поэтому в их репликации принимают участие и клеточные ферменты. В большинстве случаев кольцевые плазмиды грамотрицательных бактерий реплицируются однонаправленно в тета-форме (закрытое кольцо; рис. 3.2), а грамположительных — в сигма-форме (катящееся кольцо).

Рис. 1.4. Схема однонаправленной репликации кольцевых плазмид в тета-форме: а — строгий контроль; б— ослабленный контроль

 

Различают плазмиды со строгим и ослабленным  контролем репликации. Минимальный  размер плазмид со строгим контролем  репликации 20—30 т.п.н., а максимальный — на порядок больше. Плазмиды с  ослабленным контролем репликации обычно невелики по размеру — не более 15—30 т.п.н.

Строгость контроля репликации плазмид заключается  в наличии у них механизма ограничения числа копий до 1—3 молекул на клетку. При этом репликация кольцевых плазмид осуществляется, как правило, клеточными репликативными комплексами (реплисомами). [2]

Плазмиды Е. coli с ослабленным контролем репликации для инициации репликации используют РНК-полимеразу и ДНК-полимеразу I. Элонгацию ведет ДНК-полимераза III. В каждой бактериальной клетке содержится в среднем 40—50 плазмидных копий, такие плазмиды называют еще мультикопийными. Разница между строгим и ослабленным контролем репликации плазмид особенно заметна, когда клетки переходят из экспоненциальной фазы роста в стационарную. При этом плазмиды со строгим контролем и бактериальная хромосома перестают реплицироваться, в то время как плазмиды с ослабленным контролем продолжают дупликацию, и их масса в клетке может достигать массы бактериальной ДНК. Аналогичная картина наблюдается и в условиях остановки синтеза белков, например при добавлении в среду хлорамфеникола. Каждый раунд репликации бактериальной ДНК и плазмид со строгим контролем требует синтеза инициирующих белков, поэтому синтез этих ДНК останавливается. Плазмиды же с ослабленным контролем в таких условиях способны инициировать новые раунды репликации, поэтому их число может достигать нескольких тысяч на клетку.

Репликация  плазмид обоих классов осуществляется в основном бактериальными белками. Поскольку эти белки в клетках разных видов бактерий отличаются друг от друга, то плазмиды поддерживаются только в ограниченном числе близкородственных видов клеток. Известны, однако, примеры плазмид, имеющих широкий круг клеток-хозяев. Такие плазмиды обладают гибкой системой белков, необходимых для их поддержания в различных семействах бактерий.

Интеграция. Плазмиды со строгим контролем репликации способны к интеграции в бактериальную хромосому через IS- или Tn-элементы, содержащиеся в их геноме. При этом они подчиняются репликационному аппарату бактериальной хромосомы и могут неопределенно долго существовать в ее составе. Такие плазмиды с двойным "образом жизни" получили название эписом (например, плазмида F).

Конъюгация. Свойством многих плазмид является их способность передавать свою копию в другие клетки методом конъюгации. Плазмиды, обладающие этим свойством, называют конъюгативными. Конъюгативные плазмиды свойственны, главным образом, грамотрицательным бактериям.

 Мобилизация. Многие неконъюгативные плазмиды обладают свойством мобилизации, т. е. способностью переноситься в другие клетки с помощью конъюгативной плазмиды. У таких плазмид имеется специальный локус, обеспечивающий передачу их ДНК через "чужой" конъюгативный мостик (мобилизация in trans). Возможен и другой путь. Наличие транспозонов в плазмидах способствует их объединению друг с другом, т. е. образованию коинтегратов. Неконъюгативная плазмида может быть перенесена в другую клетку в составе коинтеграта с конъюгативной плазмидой (мобилизация in cis). Коинтеграты в реципиентных клетках распадаются на исходные репликоны, которые продолжают автономное существование.

Несовместимость. Если плазмиды не могут стабильно сосуществовать в одной клетке в условиях отсутствия селективного давления, их называют несовместимыми. Несовместимость плазмид обусловливается подавлением репликации одной из них и (или) блокированием распределения дочерних молекул ДНК по клеткам перед их делением. Эти оба механизма действуют независимо друг от друга.

Несовместимость, вызванная подавлением репликации, наблюдается у плазмид как со строгим, так и с ослабленным контролем репликации. Она обусловлена существованием у плазмид генетического механизма поддержания числа плазмидных копий на определенном уровне, который приводит к тому, что в клетке только одна из двух плазмид (резидентная или с меньшей вероятностью вошедшая) сохраняет способность к удвоению.

Несовместимость, вызванная блокированием распределения  дочерних молекул ДНК по клеткам, характерна для низкокопийных плазмид. В ее основе лежит факт конкуренции  плазмид за сайты на цитоплазматической мембране, обеспечивающие их распределение при делении клеток.

Тест  на совместимость позволяет разделять  плазмиды на группы несовместимости. У Е. coli их насчитывается более 30. Плазмиды, входящие в одну группу, несовместимы, т. е. исключают друг друга. Несовместимыми могут быть и плазмиды с разным фенотипическим проявлением. Например, в группу F1 входят плазмиды типа F (половой фактор), Col (колициногенность) и R (устойчивость к антибиотикам).

 

1.3.3. Перенос генетической информации  между микроорганизмами.

Обычно  рассматривают три типа переноса генов у бактерий. Первый тип — трансформация — процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК. В результате трансформация клетка-реципиент может приобрести и устойчиво передавать своим потомкам признак, ранее у нее отсутствующий, но имеющийся у клетки донора (например, ген устойчивости к антибиотикам). Трансформация у многих бактерий - естественный процесс.

Трансформация хорошо известна и подробно изучена  для некоторых штаммов Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Bacillus subtilis, Streptococcus sanguis, Neisseria gonorrhoeae, Acinetobacter catcoaceticus. Способность или неспособность к трансформации для любого бактериального штамма зависит от его компетентности, под которой понимают способность реципиентного штамма включать ДНК из культуральной среды внутрь клетки.

Успешное  осуществление трансформации определяется использованием высокомолекулярной двухцепочечиой ДНК и созданием специфичных условий, в которых популяция реципиентных клеток проявляет максимальную компетентность. Последнее часто зависит от таких факторов, как стадия в цикле роста популяции реципиента, питательная ценность культуральной среды, уровень аэрации, рН, наличие нужных концентраций двухвалентных катионов и в большинстве случаев генотип реципиента.

Второй  тип — трансдукция — это процесс генного переноса, при котором бактериальный вирус (бактериофаг), размножающийся в клетках бактериального штамма-донора, включает в себя часть генетической информации бактерии и после инфицирования другого, реципиентного, штамма вызывает иногда наследуемые изменения у реципиента. Реципиентная клетка, которая таким путем приобретает признаки донора, называется трансдуктантом.

Бактериальные вирусы делят на вирулентные, при  инфицировании которыми все зараженные клетки гибнут с высвобождением новых  фаговых частиц, и умеренные, вызывающие либо лизис инфицированных бактерий с высвобождением потомства новых фагов, либо их лизогенизацию. В лизогенном состоянии фаговый геном, называемый уже профагом, реплицируется синхронно с бактериальной хромосомой в форме плазмиды или включаясь в хромосому. Несмотря на то, что вирулентные фаги и вирулентные мутанты умеренных фагов способны к трансдукции, в природе основной приток генов в бактерии за счет трансдукции обусловлен лизогенными умеренными фагами, которые представляют собой наиболее простые системы для изучения.