Методы хранения культур микроорганизмов

      Бациллы и микобактерии выращивали  на органической среде, содержащей (г/л): глюкозу -10, пептон - 5.0, NаО - 5.0, агар-агар - 25 с добавлением бульона Хоттингера - 28 мг % по азоту аммония, рН 7.0; дрожжи на сусле 6-8°Б с добавлением 2.5% агар-агара, рН 6.8; грибы на сусле -3-4°Б с агаром, рН 6.0. Тесты культивировали в диапазоне 28-55°С: дрожжи и грибы - при 28°С, бациллы, стафилококки и микрококки при 37°С, кроме Е. соli, культивируемой при 42°С, и Вас. соagulans - при 55°С. Для засева чашек Петри тестами использовали суточные культуры бактерий и дрожжей и пятисуточные культуры грибов в виде суспензии клеток в физиологическом растворе в количестве 1 млрд/мл (по бактериальному стандарту мутности), исходя из расчета 0.1 мл суспензии в одну чашку Петри при глубинном культивировании.

Антибиотическую активность изучаемых молочнокислых бактерий определяли методом диффузии в агар с измерением зоны подавления роста тест-культуры [15]. 

РЕЗУЛЬТАТЫ  И ОБСУЖДЕНИЕ 

      Одним из основных показателей,  отражающих способность микроорганизмов  к восстановлению, является выживаемость культур.

В табл. 1 представлены результаты исследований о влиянии лиофилизации на выживаемость восьми культур. Как видно из результатов, в процессе лиофилизации количество жизнеспособных клеток изменилось незначительно: выживаемость составила от 50 до 70%. У гомоферментативной , бактерии Lactobacillus casei 153 после лиофилизации 65.7% клеток были жизнеспособны, выживаемость у L. Caucasicus 155 была в пределах 50%, как и у лактококков L. lactis subsp. lactis  170, 283, 284,1605(54-57%). После пяти лет хранения культур в лиофильном состоянии количество жизнеспособных бактерий значительно снизилось и в первом поссаже составило от 7.3 до 23.3%.

     После 14 лет хранения в лиофильном  состоянии количество жизнеспособных  клеток L.casei 153 в восстановленной культуре уменьшилось на один порядок ( от 9.2×10⁹ до 1.6×10⁸ ), у L.cremoris 163- на 5 порядков, у L.caucasicus 155 после

Таблица  Изменения жизнеспособности молочнокислых бактерий рода Lactobacillus после лиофилизации и пяти лет хранения в лиофльном состоянии

20 лет  хранения - на 2 порядка, у L.lactis 167 - на 2 порядка. После разных сроков хранения - от 9 до 20 лет (Leuconostoc mesenteroides хранили 35 лет) – все 17 лиофилизированных культур молочнокислых бактерий сохранили достаточно большое количество жизнеспособных клеток (от 1 х 10⁴ до 1 х 10⁸ кл/мл).

      Что же касается их бродильной  активности, то известно, что при  изменении состава среды или  при многолетнем культивировании штаммов гомоферментативные молочнокислые бактерии помимо молочной кислоты могут накапливать в среде культивирования значительные количества летучих кислот, С0₂, а также глицерин, диацетил, ацетон, этиловый спирт и, наоборот, гетероферментативные молочные бактерии могут утратить способность к образованию летучих кислот, углекислоты и спирта и перейти на гомоферментативный путь сбраживания глюкозы, что отражается на значениях титруемой кислотности.

Образование органических кислот у лиофилизированных гетероферментативных бактерий L.pentoaceticum 159 и L.lindneri 158 после 13 и 14 лет хранения при одинаковом количестве (1.0 х 10⁷) жизнеспособных клеток было больше (152.0 и 120.0°Т), чем у тех же культур, хранившихся под маслом (88.0 и 38.0°Т).

Общая титруемая кислотность гомоферментативных бактерий рода Lactococcus (L.lactis subsp.cremoris 163 и 164 и L.lactis subspdiacetilactis 165) после хранения на питательной среде под маслом от 1 года до 6 лет значительно выше, чем у лиофилизированных культур. Однако и выживае-

мость штаммов в данном случае снизилась  на 4 и 5 порядков у L.lactis subsp.cremoris 164 и 163, а у L.lactis subsp.diacetilactis 165 - на один порядок, что значительно ниже, чем при хранении этих культур под маслом. Количество жизнеспособных клеток лиофильно высушенного гетероферментативного Leuconstoc 171, хранившегося 35 лет в ампуле, составило 1.0 х 10⁷, т.е. столько же, сколько при хранении в течение года под маслом, а титруемая кислотность среды при культивировании восстановленной лиофильной культуры имела 48.0°Т, что в 1.6 раза выше.

Наибольшее  количество органических кислот отмечено у гомоферментативной бактерии L.acidophilus 147 после хранения под маслом в течение 1 года, общая кислотность составила 248.0°Т.

      Выживаемость периодически пересеваемой  культуры L.acidophilus 148 в течение 9 лет на 2 порядка ниже, чем при столь же длительном хранении ее в лиофильном состоянии, а кислотность в среде культивирования в 6.4 раза выше и составила 128.0°Т.

      У молочнокислых бактерий подрода  Termobacterium (Orla-Jenson) L.bulgaricus 152 выживаемость при периодических пересевах изменилась незначительно и сравнима с выживаемостью этого штамма в лиофильном состоянии, кислотность же в 1.8 раза ниже (41.0°Т). Количество жизнеспособных клеток при периодических пересевах лак-тококков на 3 порядка ниже, чем при хранении этих культур в лиофильном состоянии. Заметно снижена и способность к накоплению молочной кислоты у этой группы гомоферментативных бактерий. Одной из причин снижения выживаемости культур и их физиологической активности при многочисленных пассажах является изменение состава популяции под действием ряда физико-химических факторов внешней среды и процесса высыхания культур, накопление в культуре биологически неактивных диссоциантов [17].

       Антибиотическая активность молочнокислых бактерий складывается из действия продуцируемых бактериоцинов, а также кислот, спиртов, перекисей и других метаболитов, накапливаемых в процессе их роста и развития. Представители рода Lactobacillus отличались широким спектром антибиотической активности по сравнению с бактериями рода Lactococcus. Исследованные штаммы подавляли рост как грамположительных бактерий, включая факультативно-анаэробные кокки Staphylococcus aureus и Micrococcus luteus, аэробные коринеформные бактерии Mycobecterium smegmatis и споровые Bacillus mycoides, Bac.subtilis, так и грамотрицательных бактерий, таких, как факультативно-аэробные палочки E.coli, аэробные палочки Pseudomonas fluorescens, но почти не ингибировали рост кислото- и термоустойчивой бактерии Bac.coagulans и грамотрицательных палочек Alcaligenes faecalis, факультативно-аэробных Serratia marcescens, Proteus vulgaris. Исследованные штаммы рода Lactobacillus не подавляли рост дрожжей Candida guilliermondii, Rhodotorula aurantiaca, Saccharomyces cerevisiae, а также микроскопических нитчатых грибов Aspergillus niger, Fusarium oxysporum. Спектр антимикробного действия лактококков сравним с действием лактобацилл. И в то же время штаммы Lactococcus lactis subsp.lactis 167, 284 активно подавляли рост грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, а также дрожжей Candida guilliarmodii, грибов Asp.niger и Fusarium. Наблюдалась некоторая тенденция к снижению антибиотической активности у лиофилизированных культур, что, возможно, связано с повреждением уклеиновых кислот, внутриклеточных белков, пептидов в процессе лиофилизации [18] либо с накоплением в популяции неактивных диссоциантов [17].     Периодические пассажи лиофилизированных культур молочнокислых бактерий и поддерживающая селекция восстанавливали их физиологическую активность.

Таким образом, лиофилизация обеспечивает длительную жизнеспособность культур молочнокислых  бактерий. Способ хранения под вазелиновым маслом обеспечивает высокий уровень выживаемости лактобацилл и малоэффективен для хранения лактококков. При периодических пересевах культуры молочнокислых бактерий требуют подращивания в обрате как элективной богатой среде их обитания для восстановления их жизнеспособности и регенерации их антибиотических свойств.

      Исследования по гарантированному  поддержанию коллекции чистых культур молочнокислых бактерий разными методами; периодические пересевы, хранение под маслом при температуре 20°С и в лиофильном состоянии при 4° С – продолжаются. Поэтому при необходимости длительного хранения культур следует индивидуально разработать условия хранения отдельных штаммов микроорганизмов с целью обеспечения не только их выживаемости, но и сохранения физиолого-биохимических свойств, которые представляют особую ценность.

Работа  выполнена в рамках программы "Биологическое разнообразие". 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Заключение.

В ходе проведенной  работы была изучена научная литература и экспериментальные статьи по методам  хранения культур микроорганизмов. Каждый метод по своему удобен. Из этого  можно сделать заключение: 

- Периодические пересевы на питательные среды, это способ широко используется в микробиологической практике.

-  Хранение под минеральным маслом, широко используется для бактерий и микроскопических грибов.

- Хранение в лиофилизированном состоянии, длительное сохранение микроорганизмов.

- Хранение при низких и сверхнизких температурах, наиболее универсален, т.к. микроорганизмы храниться при низких и сверх низких температурах.

- Хранение в глицероле, хранение микроорганизмов при низких темпераурах в растворах глицерола.

- Хранение в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлорида натрия, не требует специального обрудования.

- Хранение в высушенном состоянии на адсорбентах, применяют для актиномицетов, микроскопических грибов и анаэробных бактерий, образующих споры. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Список  литературы 

1. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и их использование. М.: Наука, 1957. С.23, 290-359. 

2. Klaenhammer T.R. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1993. № 12. Р.39-86. 

3. Беккер М.Е., Дамберг Б.Э., Раппопорт А.И. Анабиоз микроорганизмов. Рига: Зинатне, 1981. С. 253. 

4. Сидякина Т.М.  Консервация микроорганизмов в  коллекциях культур. Консервация генетических ресурсов. Методы. Проблемы. Перспективы. Пущино, 1991. С. 81-159. 

 5. Maitenance of microorganisms and cultured cells. A manual of  laboratory methods/ Eds.Kirsop B.E., Doyle A. London, New York: Academ. Press, 1991. 308 p.