Методы хранения культур микроорганизмов

При температуре  хранения от —20 до —40° хорошо выживают немногие микроорганизмы; значительно эффективнее хранение при —70° в твердой углекислоте и особенно в условиях сверхнизких температур: при —196° (жидкий азот) или при —210° (газовая фаза жидкого азота).

1.5.Хранение в глицероле. Одним из самых удобных методов хранения микроорганизмов является их содержание при низких температурах (—20°) в растворах глицерола, который служит криопротектором. Данный способ широко распространен, однако не все микроорганизмы выдерживают такую обработку. Поэтому считается, что для клеток, подвергаемых замораживанию в глицероле, необходимы предварительные эксперименты по определению степени выживаемости их. Наибольшее распространение этот способ консервации микроорганизмов получил при хранении суспензий различных спор.

     Для проведения экспериментов по хранению готовят 50%-ный раствор глицерола в дистиллированной воде и стерилизуют его при 1 ати в течение 30 мин. Клетки из выросших культур (обычно из середины экспоненциальной фазы роста), предназначенные для хранения, смешивают в пропорции 1:1 с 50%-ным глицеролом, перемешивают и ставят в морозильник. Хранить суспензии удобно в стерильных пробирках Эппендорф, а для их приготовления использовать автоматические пипетки со стерильными наконечниками и готовить смеси в ламинарном .шкафу. Из сохраняемых клеток периодически (2—6 раз в год) отбирают пробы для проверки на выживаемость. В зависимости от результатов проверки рассчитывают схемы консервации той или иной культуры и периодичности их пересева.

Для культур  микроорганизмов с твердых сред перед смешиванием с глицеролом готовят суспензии в жидкой среде или в оптимальном для хранения буферном растворе (проверяется экспериментально). Можно также суспендировать клетки с твердых сред непосредственно в 25%-ном стерильном глицероле.

1.6.Хранение в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлорида натрия. Хранение, микроорганизмов в дистиллированной воде пли в 1%-ном растворе NaCl не требует специального оборудования и доступно любому экспериментатору. Допустимые сроки хранения некоторых микроорганизмов этими методами приведены на таблице.

Микроорганизмы  предварительно выращивают в оптимальных условиях, после чего клетки суспендируют в дистиллированной моде или 1%-ном растворе хлорида натрия. Успешному сохранению клеток способствует высокая плотность суспензии — не менее 10⁸—10⁹ клеток и 1 мл. Суспензию разливают в стерильные пробирки или флаконы и сохраняют в холодильнике или при комнатной температуре. Оставлять на хранение рекомендуется клетки напила стационарной фазы роста культуры или сформировавшиеся покоящиеся формы — поры, цисты. 

Таблица

 Допустимые сроки хранения (месяцы)

микроорганизмов в дистиллированной воде

и 1%-ном  растворе NaCl 

Микроорганизмы Дистиллирована  вода 1% -ный раствор NaCl Achromobacter     liquefaciens 6 6 Escherichia coli 12 12 Gluconobacter oxydans 12 6 Bacillus  subtilis 12 12 Micrococcus aurantiacus 12 12 Pseudomonas aeruginosa 6 6 Micrococcus luteus 6 6 Serratia marcescens 12 12

 1.7.Хранение в высушенном состоянии на адсорбентах. Этот метод применяют главным образом для актиномицетов, микроскопических грибов и анаэробных бактерий, образующих споры. В качестве адсорбентов используют почву, кварцевый песок, силикагель, вату, фильтровальную бумагу. Разработанной стандартной техники этот способ не имеет. В самом общем виде он сводится к тому, что стерильный адсорбент, помещенный в ампулы, смешивают с густой суспензией клеток и высушивают под вакуумом или при комнатной температуре. Затем ампулы запаивают и хранят при комнатной температуре или в холодильнике. Имеются данные, что у актиномицетов после хранения в почве или в кварцевом песке восстанавливаются некоторые таксономические признаки (окраска воздушного и субстратного мицелия), которые были утрачены в процессе длительного культивирования в лаборатории.

1.8.Оценка жизнеспособности микроорганизмов после длительного хранения. Жизнеспособность микроорганизмов после различных сроков хранения определяют путем высева их на богатые питательные среды с последующим подсчетом выросших колоний. Процент выживаемости микроорганизмов определяют по отношению числа сохранившихся клеток к первоначальному числу жизнеспособных клеток (до начала хранения), принятому за 100%.

Глава 2. Экспериментальные часть.

2.1. МЕТОДЫ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ КОЛЛЕКЦИИ

МИКРООРГАНИЗМОВ КАФЕДРЫ МИКРОБИОЛОГИИ

МОСКОВСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА 

      Коллекция культур микроорганизмов кафедры микробиологии МГУ хранится в основном с помощью методов лиофилизации и под вазелиновым маслом. В лиофилизированных культурах спустя 35–36 лет хранения наблюдалось высокое число жизнеспособных клеток. Под вазелиновым маслом микроорганизмы хранятся от 1 года до 12 лет в зависимости от их свойств. Установлены оптимальные и предельные сроки пересевов при хранении под маслом для микроорганизмов различных таксономических групп. 

      Коллекция микроорганизмов кафедры микробиологии МГУ (КМ МГУ) начала создаваться с 1924 г. под руководством академика В.Н. Шапошникова силами научных сотрудников, аспирантов, студентов и пополняется в процессе работы. Главная задача учебной коллекции – обеспечить культурами микроорганизмов различных таксономических групп учебный и научный процессы кафедры и факультета. В начале существования коллекции культуры поддерживали с помощью периодических пересевов. Это был трудоемкий процесс, требующий затраты большого количества сред и времени. С 1959 г. был начат переход к более экономичному методу хранения культур с помощью лиофилизации. С 1973 г. стал использоваться метод хранения культур под вазелиновым маслом. Затем были испытаны другие известные из литературы способы хранения: в 25%-ном растворе глицерина при -20°С, в дистиллированной воде и физиологическом растворе при 6°С.[1,2]

В настоящей  работе представлены результаты по длительному  хранению культур этими разнообразными методами. 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 

      Объектами исследования служили микроорганизмы из коллекции кафедры микробиологии МГУ.

Лиофилизация. Лиофилизировали молодые культуры микроорганизмов, выращенные на среде, соответствующей их физиологическим потребностям. Микроорганизмы смывали с агаризованного субстрата защитной средой. В случае выращивания микроорганизмов на жидкой среде использовали центрифугирование, осадок клеток заливали защитной средой. В качестве защитных сред использовали: 1% желатина +10% сахарозы, снятое молоко и снятое молоко +7% глюкозы. В ампулы разливали по 0.3 мл густой суспензии клеток, содержащей 1 х 10⁸–1 х 10¹⁰ клеток в 1 мл. Замораживали погружением ампул в смесь спирта с твердой углекислотой при -35.. .-40°С в начале и -60...-70°С в конце замораживания. Высушивали под вакуумом до остаточной влажности 2.5–4.5%. Остаточную влажность определяли путем высушивания в течение 1 ч при 100°С. Запаивали при остаточном давлении 0.5–1.7 мм ртутного столба. Имевшаяся аппаратура, к сожалению, не обеспечивала более глубокого вакуума. Ампулы хранили при 3-6°С.

      Хранение под вазелиновым  маслом. Микроорганизмы выращивали на соответствующей их потребностям агаризованной среде, скошенной под углом 45°, до начала стационарной фазы роста, а бациллы – до стадии спороношения. Предварительно стерилизовали медицинское вазелиновое масло в автоклаве 2 раза при 1 атм 1 ч. Затем его прогревали при 150°С в сушильном шкафу для удаления воды. Выросшие культуры заливали вазелиновым маслом слоем 1.5–2см и хранили при комнатной температуре. Перед следующим закладыванием на хранение под маслом проводили два-три пассажа на питательной среде.

      Хранение при низкой  температуре (-20°С). Густую суспензию микроорганизмов получали смывом с агаризованной питательной среды 25%-ным водным раствором глицерина. Взвесь разливали по 3 мл в стерильные флаконы на 5 мл, закрывали резиновыми пробками. Хранили при -20°С.

      Хранение в дистиллированной  воде и физиологическом растворе. Микроорганизмы смывали с поверхности скошенной питательной среды дистиллированной водой или 0.85%-ным водным раствором NaCI Взвесь разливали по 3 мл в стерильные флаконы на 5 мл, закрывали резиновыми пробками. Хранили при 3-6°С. Для определения жизнеспособности культур использовали метод последовательных разведений с высевом на среды, соответствующие физиологическим потребностям данного микроорганизма (таблица 1).  

Таблица 1. Изменение жизнеспособности микроорганизмов при хранении лиофилизированных культур в течении 35-36 лет.

* Знак “плюс” означает, что установлена жизнеспособность микроорганизмов без количественного учета. 
 

РЕЗУЛЬТАТЫ  И ОБСУЖДЕНИЕ

      В 1959 – 1960 годах на кафедре  микробиологии МГУ были лиофилизированы  сапрофитные микроорганизмы различных таксономических групп.

      При этом сравнивали выживаемость микроорганизмов с использованием разных защитных сред. Наилучшую выживаемость в процессе лиофилизации обеспечивали две защитные среды: 1% желатина +10% сахарозы и снятое молоко +7% глюкозы [3] . Затем в течение длительного хранения проверяли количество жизнеспособных клеток сравнительно с начальным количеством их, сохранивших жизнеспособность после лиофилизации [4,5].

 В таблице № 1 представлены данные по изменению количества жизнеспособных клеток за 36 лет хранения. Как видно из приведенных результатов, по мере хранения наблюдается медленное падение числа жизнеспособных клеток. У некоторых микроорганизмов это снижение слабее, у других сильнее. Практически не наблюдалось разницы в отмирании клеток на трех защитных средах, хотя при проведении лиофилизации защитные среды "желатин + сахароза" и "молоко + глюкоза" обеспечивали значительно более высокий процент выживаемости, чем "молоко"[3]. Важно высокое начальное количество жизнеспособных клеток фазу после ли-офилизации. В таких случаях через 35-36 лет число жизнеспособных клеток в ампулах оставалось очень большим.

После предварительных исследований была лиофилизирована вся коллекция микроорганизмов при использовании в качестве защитной среды "желатин + сахароза". Хранение микроорганизмов в лиофилизированном состоянии для больших коллекций очень экономично. А проверка физиолого-биохимических свойств микроорганизмов после лиофилизации показала, что их свойства не изменялись.

      После хранения в течение 33-36 лет была проверена жизнеспособность 80 штаммов лиофилизированных микроорганизмов. Из табл. 2 следует, что большинство исследованных штаммов сохранили высокое число жизнеспособных клеток - порядка 1 х 10⁴—1 х 10⁷ клеток в ампуле.

После 33 лет хранения в лиофилизированном  состоянии сохранили жизнеспособность 14 штаммов грибов: Aspergillus niger 399, 400, 401, 402, Aspergillus fumigatus 403, 404, 405, Aspergillus ochraceus 406, 407, 408, Aspergillus oryzae 409, Fusarium sр. 410,411, Citromyces glaber 412. Погиб штамм Аlterпaria sр. 413.