Методы хранения культур микроорганизмов

ХАНТЫ-МАНСИЙСКИЙ АВТОНОМНЫЙ ОКРУГ – ЮГРА

СУРГУТСКИЙ  ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  УНИВЕРСИТЕТ 

Биологический факультет

Кафедра микробиологии 
 
 
 
 
 
 
 

КУРСОВАЯ РАБОТА 
 

Тема  «Методы хранения культур микроорганизмов.» 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Выполнила: студентка 05-56 группы III курса

Биологического  факультета

Литвиченко 

Виктория 

Сергеевна.

Проверил:

преподаватель

Ямпольская  Татьяна Даниловна.  
 
 
 
 
 

Сургут  – 2008

Оглавление. 

Введение - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 3

Глава 1. Хранение микроорганизмов- - - - - - - - - - - - - - - - -4

1.1 Периодические  пересевы на питательные среды- - - - - -4

1.2.Хранение под  минеральным маслом- - - - - - - - - - - - - -  4

1.3 Хранение в  лиофилизированном состоянии- - - - - - - - - 5

1.4.Хранение при низких и сверхнизких температурах- - - -6

1.5.Хранение в  глицероле- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -7

1.6.Хранение в  дистиллированной воде или

       1%-ном растворе хлорида натрия- - - - - - - - - - - - - - - - 7

1.7.Хранение в высушенном состоянии на адсорбентах- - - 8

1.8.Оценка жизнеспособности  микроорганизмов

       после длительного хранения- - - - - - - - - - - - - - - - - - - 8

Глава 2. Экспериментальные часть.- - - - - - - - - - - - - - -  9

2.1 Методы длительного  хранения коллекции

       микроорганизмов кафедры  микробиологии МГУ- - - - 9

2.2 Сравнение  способов хранения молочнокислых 

       Бактерий- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 16

Заключение- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 23

Список литературы- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Введение 

      Необходимым условием успешной работы с микроорганизмами является правильное поддержание их с целью сохранения не только жизнеспособности клеток, но и таксономических, а также любых других, важных для исследователя свойств. Общего метода, одинаково пригодного для хранения многочисленных и разнообразных групп микроорганизмов, пока не существует. Поэтому в крупных коллекциях разные группы микроорганизмов сохраняются различными методами. Кроме того, чтобы исключить возможность потери микроорганизма, каждый штамм сохраняется не одним, а несколькими способами. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Глава 1. ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ 

      К числу наиболее распространенных способов хранения микроорганизмов относятся периодические пересевы на свежие питательные среды, сохранение культур на питательной среде под вазелиновым маслом, хранение клеток в лиофилизированном состоянии. Значительно реже микроорганизмы сохраняют при низких или сверхнизких температурах, в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлористого натрия, на адсорбентах в высушенном состоянии. Выбор метода хранения во многом зависит от целей, для которых используются микроорганизмы, а также от имеющегося в распоряжении исследователя оборудования.

1.1 Периодические пересевы на питательные среды. Этот способ был одним из первых приемов длительного сохранения микроорганизмов в лабораторных условиях и до настоящего времени широко используется в практике микробиологических работ. Аэробные микроорганизмы пересевают чаще всего на поверхность скошенной агаризованной среды, микроаэрофилы — в полужидкую среду, содержащую 0,2—0,3% агара, анаэробы — в толщу плотной среды или в жидкую среду. Культуры пересевают на свежие среды в 2 пробирки (колбы). В дальнейшем из одной пробирки микроорганизмы используют для работы, культуру во второй пробирке оставляют для сохранения и последующего пересева.

      Частота пересева на свежую среду различных микроорганизмов неодинакова и в большой степени определяется их свойствами. Многие микроорганизмы можно пересевать один раз в 1—2 месяца, хотя есть микроорганизмы, например молочнокислые бактерии, которые нуждаются в более частых пересевах. Допустимые сроки пересевов некоторых микроорганизмов приведены в Приложении. Хранение культур в холодильнике при 4—6° позволяет увеличить время между пересевами.

Поддержание культур микроорганизмов регулярными  пересевами имеет ряд существенных недостатков. Основной из них — возможная утрата некоторых морфологических и физиологических признаков. Кроме того, частые пересевы нередко снижают биохимическую активность культур, повышают опасность инфицирования ее посторонними микроорганизмами. При частых пересевах, особенно на жидкие среды, велика вероятность возникновения спонтанных мутантов и их селекция.

1.2.Хранение под минеральным маслом. Хранение под минеральным маслом широко используется для бактерий и микроскопических грибов. Этот метод обеспечивает довольно длительное сохранение жизнеспособности и стабильности таксономических и других признаков у микроорганизмов различных систематических групп. Масло предотвращает высыхание среды, замедляет процессы метаболизма и позволяет увеличить время между пересевами.

Микроорганизмы  выращивают на благоприятной агаризованной питательной среде; аэробные микроорганизмы — на поверхности коротко скошенной (под углом 45°) среды, микроаэрофилы и факультативные анаэробы — в полужидкой среде, анаэробы — в толще .среды (посев уколом или в расплавленную среду с перемешиванием). После того как культуры хорошо разовьются, их заливают маслом. Как правило, аспорогенные бактерии заливают через 2—7 суток после посева в зависимости от скорости роста микроорганизма, бациллы и актинонимицеты — в стадии сформировавшихся покоящихся форм. Дрожжи рекомендуется заливать маслом через 4—10, мицелиальные грибы — через 7—12 суток.

Наиболее  пригодно для заливки культур микроорганизмов высокоочищенное медицинское вазелиновое масло с плотностью 0,8—0,9. Предварительно масло стерилизуют 1 ч в автоклаве при 121° (1 ати), а затем для удаления влаги прогревают в течение 1 ч в сушильном шкафу при температуре не выше 150° или оставляют на двое - трое суток при комнатной температуре. Культуры заливают маслом так, чтобы слой его не превышал 1 см над средой или верхним краем скошенной среды, и сохраняют при комнатной температуре либо в холодильнике при 4—6°.

      Для пересева клетки из-под масла отбирают петлей и, удалив излишек масла проведением петли по стенке пробирки, переносят на свежую питательную среду. Рекомендуется использовать среду того же состава, на которой культуру хранили. Многие микроорганизмы в первом пассаже после хранения под маслом развиваются медленнее, однако при последующих пересевах скорость роста их восстанавливается.

Метод хранения микроорганизмов под вазелиновым  маслом прост, удобен в обращении, может  быть использован в любой лаборатории. К недостаткам его можно отнести возможность инфицирования помещения микроорганизмами за счет разбрызгивания масла при обжигании петли, а также необходимость специальной очистки посуды от масла.

1.3 Хранение в лиофилизированном состоянии. Хранение лиофильно – высушенных клеток — широко распространенный метод длительного сохранения микроорганизмов. Лиофилизацией называют процесс высушивания под вакуумом замороженных клеток. Лиофильно-высушенные клетки сохраняют в ампулах, запаянных под вакуумом. Применение этого метода позволяет в течение 10—20 и более лет сохранить без заметных изменений жизнеспособность, морфологические, культуральные, физиологические свойства, а также биохимическую активность клеток.

Микроорганизмы, подлежащие лиофилизации, выращивают в оптимальных условиях до начала стационарной фазы роста или окончания  формирования покоящихся форм. Затем клетки или соответственно покоящиеся формы суспендируют в специальных жидкостях, получивших название защитных сред. В состав защитных сред входят различные вещества, которые предохраняют клетки от повреждений в период замораживания и высушивания. 11иже приведены рецепты некоторых защитных сред, используемых для лиофилизации клеток различных микроорганизмов:

1.  Желатина                          — 1 г;

сахароза                                — 10 г;

вода дистиллированная         — 100 мл.

2. Молоко обезжиренное       — 100 мл;

глюкоза                                 — 7 г.

3.  Молоко  обезжиренное       —  100 мл;

NH₄C1                                   — 0,5 г;

аскорбиновая, кислота            — 0,5 г;

 тиомочевина                           — 0,5 г.

4.  Лошадиная  сыворотка        — 75 мл;

мясной бульон                       — 25 мл;

глюкоза                                      — 7,5 г. 

      Для успешной лиофилизации плотность в защитной среде должна быть как можно более высокой — 10⁹—10¹⁰ клеток в 1 мл. Полученную суспензию разливают в ампулы из нейтрального стекла по 0,5—1,0 мл, замораживают при температуре от —20 до —70°, затем высушивают и запаивают под вакуумом. Остаточная влажность лиофилизированных клеток колеблется от 1 до 6% и определяется составом защитной среды и режимом высушивания. В различных лабораториях режимы замораживания и высушивания заметно варьируются и во многом зависят от имеющегося оборудования. Ампулы с лиофильно-высушениыми клетками рекомендуется сохранять в темноте при температуре 4—6°. Хранение при более высокой температуре, особенно превышающей 25—30°, заметно снижает выживаемость клеток.

Для реактивации  к лиофилизированным клеткам  добавляют по каплям стерильную дистиллированную или водопроводную воду в количестве 0,5—1,0 мл. После регидратации клетки высевают на богатые питательные среды.

Лиофилизацию  широко применяют для длительного  хранения различных микроорганизмов. Тем не менее этот метод нельзя считать универсальным. Следует  отметить, что к лиофилизации более устойчивы грамположительные, чем грамотрицательные бактерии. Очень плохо переносят ее фототрофные и хемолитотрофные бактерии, микоплазмы, многие облигатные анаэробы. Выживаемость спор после лиофилизации заметно выше, чем вегетативных клеток. Дрожжи с мелкими клетками и аскоспорами родов Pichia и Hansenula выдерживают лиофилизацию лучше, чем слабоспорулирующие или неспорулирующие крупные клетки дрожжей родов Sacchawmyces, Kluyveromyces, Rhodotorula.

1.4.Хранение при низких и сверхнизких температурах. Хранение микроорганизмов в замороженном состоянии при низких и сверхнизких температурах по сравнению с другими методами характеризуется наибольшей универсальностью. Однако этот метод требует специального оборудования и большой осторожности в работе с жидким азотом, поэтому используется лишь для сохранения микроорганизмов, не выдерживающих лиофилизацию.

Клетки замораживают при разных температурах (от —10 до — 196°) и различных скоростях замораживания. Для защиты от повреждающего действия низких температур клетки предварительно суспендируют в растворах криопротекторов. Чаще других применяют 10—20%-ный раствор глицерина, 7—10%-ный раствор диметилсульфоксида или 20%-ный раствор сахарозы. Суспензию клеток с высокой плотностью (10⁹—10¹⁰ клеток в 1 мл) разливают в ампулы или флаконы с завинчивающейся крышкой. Ампулы запаивают и помещают в холодильник с температурой —70°, а затем переносят в жидкий азот, где и. сохраняют при —196°. Оттаивание замороженных клеток должно быть как можно более быстрым. Поэтому ампулы погружают на 2 мин в водяную баню с температурой 35—45°. Клетки из ампул высеивают на богатые питательные среды.