Методы хранения культур микроорганизмов

      Молочно-кислые бактерии были  лиофилизированы позднее, и в настоящее время срок хранения ампул составляет 13-18 лет. За этот срок сохранили жизнеспособность все 16 лиофилизированных культур молочно-кислых бактерий: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei (2 штамма), Lactobacillus «caucasicus», Lactobacillus delbrueckii (2 штамма), Lactococcocus lactis (2 штамма), Lactococcocus lactis subsp. cremoris (2 штамма), Lactococcocus lactis subsp. diacetilactis, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus pentoaceticum (2 штамма), Lactobacillus plantarum (2 штамма).

      На основании многолетних наблюдений по хранению большого числа микроорганизмов под вазелиновым маслом [6-8] и продолжающихся в настоящее время исследований были установлены оптимальные и предельные сроки хранения под маслом для микроорганизмов, принадлежащих к различным таксономическим группам. Некоторые культуры микроорганизмов сохраняли жизнеспособность под вазелиновым маслом без пересевов в течение 10-12 лет. Это бактерии родов Azotobacter (7-10 лет), Bacillus (8-12 лет), Мусobacterium (7-10 лет). Для Pseudomonas fluoresces Pseudomonas putida  и была установлена зависимость продолжительности хранения от состава среды, на которой хранились под маслом эти бактерии: на синтетической среде они сохраняли жизнеспособность 10-14 лет, а на мясопептонном агаре только 5-7 лет. Некоторые микроорганизмы требуют частых пересевов (0.5-1 год) при хранении под маслом, например бактерии родов Acetobacter,Cluconobacter, Lactobacillus, Lactococcus (табл. 3).

      Хранение при -20°С в 25%-ном  растворе глицерина было испытано для 20 штаммов микроорганизмов. Жизнеспособность микроорганизмов проверили после 12 мес. хранения. Из 20 штаммов сохранили жизнеспособность 19 штаммов: Alcaligenessh., Arthrobacter chrystallopoetes, Azotobacer chroococcum, Brevibacterium citreum, Citrobacter freundii, Escherichia coli, Micrococcus liteus, Mycobacterium mucosum (3 штамма), Micobacterium smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Rhodotorula aurantiaca, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula rubra (3 штамма). Погиб один штамм Pseudomonas fluorescens. Хранение в этих условиях продолжается.

В дистиллированной воде и физиологическом растворе сохраняли жизнеспособность Р. aeruginosa, Р. fluorescens, Е. cjli, Staph. aureus - 1 год, В.subtlis, Gluconobacter oxydans, Rhodococcus cp.—2 года, Serratia marcescens— 7 лет.

      На основании исследований, проведенных  на кафедре микробиологии МГУ,  было установлено, что для длительного хранения большого числа микроорганизмов в коллекции наиболее удобны метод лиофилизации и хранение под вазелиновым маслом. Лиофилизация обеспечивает более продолжительное сохранение культур, чем хранение под вазелиновым маслом. Предельные сроки хранения под вазелиновым маслом микроорганизмов различных таксономических групп колеблются от 1 до 12 лет. А лиофилизированные культуры сохранили жизнеспособность в течение 35-36 лет. Причем в этих ампулах наблюдается еще большое количество жизнеспособных клеток. Хранение лиофилизированных культур и под маслом продолжается.

      Результаты по хранению микроорганизмов,  полученные на кафедре микробиологии  МГУ, согласуются с данными, изложенными в английском руководстве по хранению культур [1]. Однако в этом руководстве нет сведений о хранении в лиофилизированном состоянии таких бактерий, как Acetobacter, Azotobacter, Rhizobium, для которых на кафедре микробиологии количественно прослежена высокая выживаемость в течение 35-36 лет. Для некоторых бактерий в руководстве приводится выживаемость за более короткие сроки хранения, чем в настоящей работе.

На кафедре  микробиологии установлена возможность более длительного хранения бактерий под вазелиновым маслом, чем указано в руководстве [1] . Это касается, например, родов Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas(таблица 2). 
 
 
 
 
 
 
 

МЕТОДЫ  ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ КОЛЛЕКЦИИ  МИКРООРГАНИЗМОВ

Таблица2. Оптимальные интервалы пересевов микроорганизмов из-под масла и предельные сроки хранения.

* Хранение на МПА

** Хранение на синтетической среде

      В настоящее время коллекция  кафедры микробиологии МГУ насчитывает свыше 400 штаммов микроорганизмов. Надежность их сохранения обеспечивается с помощью использования различных вышеуказанных способов.

Работа  частично финансировалась Министерством науки и технической политики Российской Федерации в рамках ГНТП "Средства обеспечения исследований по физико – химической биологии и биотехнологии", а также по проекту ГНТП "Биологическое разнообразие". 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

2.2.СРАВНЕНИЕ СПОСОБОВ ХРАНЕНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ. 

      Изучали влияние разных способов  хранения, таких, как хранение  под вазелиновым маслом и в  лиофилизированном состоянии, а также при периодических пересевах ряда штаммов молочнокислых бактерий из коллекции культур микроорганизмов кафедры микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова. Были исследованы 20 штаммов родов Lactobacillus и Lactococcus по физиолого-биохимичес-ким свойствам, включая их жизнеспособность в процессе лиофилизации и длительного хранения, способность к накоплению органических кислот, а также их антибиотическую активность. Установлено, что хранение под маслом неэффективно для молочнокислых лактококков Lactococcus lactis subsp.1асtis, лиофилизация сохраняет достаточно большое число жизнеспособных клеток, но несколько снижает антибиотическую активность молочнокислых бактерий. Периодические пересевы лиофилизированных культур в обогащенные питательные среды (обрат) восстанавливали их физиологическую активность, включая их антимикробный спектр действия.

Ключевые  слова: молочнокислые бактерии, лиофилизация, хранение под вазелиновым маслом, периодические пересевы, жизнеспособность, титруемая кислотность, антимикробный спектр действия.

      В литературе часто встречаются  факты, свидетельствующие о нестабильности ряда свойств у молочнокислых бактерий [1,2].

      Традиционные методы поддержания  культур микроорганизмов сводятся  к их выращиванию на богатых питательных средах с частыми пересевами. При этом имеют место мутационные изменения и автоселекция, что часто приводит к потере у штаммов важных физиолого-биохимических свойств.       Длительное хранение культур без потери ценных свойств у продуцентов возможно, если резко затормозить все протекающие в них жизненные процессы, в том числе и генетические перестройки. При этом культура переводится в состояние, близкое к анабиозу [3,4].

Известны  многие способы хранения культур  молочнокислых бактерий: при периодических пересевах, в 25%-ном растворе глицерина при -20°С, под слоем вазелинового масла на агаризо-ванной среде и в лиофильном состоянии [5-7]. Ни один из известных способов хранения не является универсальным [4,8].

      Задача данной работы состояла в изучении стабильности некоторых важных физиолого-биохимических свойств: жизнеспособности клеток, бродильной и антибиотической активностей у молочнокислых бактерий при разных условиях хранения. 

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

      Объектами исследований служили 20 культур молочнокислых бактерий из коллекции культур кафедры микробиологии МГУ. Были использованы различные способы хранения.

Лиофилизация. Культуры молочнокислых бактерий, выращенные на жидкой среде, соответствующей их физиологическим потребностям до стационарной стадии роста, центрифугировали с целью отделения клеток, ресуспендировали в защитной среде и лиофилизировали на установке фирмы "Крист" марки Бетта А (Германия) под вакуумом при температуре -30°С до остаточной влажности 2.5-4.0%. В качестве защитной среды использовали водный раствор, содержащий 10 г/л желатина и 100 г/л сахарозы как криопротекто-ры, снижающие величину активности воды и изменяющие осмотическое давление в среде, что повышало устойчивость микроорганизмов к дегидратации. Лиофильно высушенные штаммы хранили в ампулах при 4°С в условиях бытового холодильника. После лиофилизации и в процессе длительного хранения культуры восстанавливали в обезжиренном стерильном молоке (обрате) и определяли количество жизнеспособных клеток посредством высева из серии разведений в физиологическом растворе на модифицированную среду МК.5 следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт - 5, глюкоза  20, К₂НР0₄ • ЗН₂0 - 2.0, ацетат натрия - 5, цитрат аммония - 2, МgS0₄ • 7Н₂0 - 0.2 МnS0₄ - 0.05, твин-80 - 1 мл, цистеин 0.4%-ный -25 мл, агар-агар - 20, МПБ - 1 л (рН 6.2-6.5).

      Восстановленные штаммы культивировали  в ферментационных средах для изучения их физиолого-биохимических свойств как сразу после лио-филизации, так и в ряде пассажей и после 5, 7, 9, 14,15, 20, а Leuconostoc mesenteroides после 35 лет хранения. Бактерии рода Lactococcus, такие, как L. Lactis subsp. Lactis L. Lactis subsp. cremoris выращивали в обрате и в жидкой среде МКЗ вышеуказанного состава без агара, а бактерии рода Lactobacillus (L.acidophilus, L.bulgaricus, L.casei, L.lindneri. L.plantarum, L.pentoaceticum), Lactococcus lactis subsp.diacetilactis и Leuconostoc mesenteoides выращивали в 8°Б (Балг) сусле с дробиной (раздробленные проросшие зерна ячменя) с добавлением стерильного мела для нейтрализации продуктов обмена в течение 20-24 ч.

Лактококки культивировали при 30°С, а лактобациллы - при 37°С.

      Хранение под вазелиновым  маслом. Одновременно 13 штаммов хранили под стерильным медицинским вазелиновым маслом в полужидкой среде МRS того же состава, но с 0.15% агара. Для хранения под маслом культуры выращивали в пробирках с 10 мл полужидкой среды МRS в течение 48^-72 ч. Затем среду нейтрализовали 10%-ным раствором NаНСОз и заливали стерильным маслом, чтобы высота слоя масла над поверхностью инкубационной среды была равна 1.5 см. Продолжительность хранения культур под слоем масла составляла 12 мес. В качестве контроля использовали культуры молочнокислых бактерий, хранившиеся в пробирках в виде молочного сгустка в условиях бытового холодильника при 4°С, которые периодически пересевали 1 раз в 30 сут в обрат и жидкие среды вышеуказанного состава применительно к конкретному штамму. По истечении срока хранения изучали изменение выживаемости бактерий, их бродильной активности и способности к синтезу бактериоцинов.

Затем культуру микроорганизмов переносили опять в обрат, культивировали при  оптимальных для каждого штамма температурных режимах до образования  молочного сгустка и закладывали  для последующего срока хранения.

      Количество живых клеток определяли  прямым подсчетом колоний, выросших на чашках Петри после инкубирования на среде МКЗ с добавлением 2.5%-ного агар-агара, из серийных 10-кратных разведений в физиологическом растворе (0.8% NaCl) бактериальных суспензий после восстановления культур из лиофильного состояния и после разных условий хранения.

Как показатель бродильной активности молочнокислых бактерий (способности к накоплению органических кислот) определяли общую титруемую кислотность при росте их в жидких средах [11]. Общую титруемую кислотность выражали в градусах Тернера, как количество мл 0.1 N КаОН, необходимое для нейтрализации образовавшейся в процессе роста и развития кислоты (1°Т = 0.0075% молочной кислоты).

      Поскольку одним из основных показателей физиолого-биохимической активности молочнокислых бактерий является их способность к синтезу бактериоцинов, различающихся по химической структуре и спектру антимикробного действия [1, 12-14], изучали их антибиотическую активность по отношению к разным группам микроорганизмов. В качестве тест-культур использовали 6 штаммов грамотриЦательных бактерий: Alcaligenec faecalis 82, Сотатопаз acidovorans45, Еscherichia соli 52, Pseudomonas fluorescens 80, Рroteus vulgaris 206, Serratia таrсеsсепs 208; 6 штаммов грамположительных бактерий: Ваcillus соаgи1апs 429, Ваcillus тусоides 32, Васillus subtilis 2, Мucrococcus luteus 128, Мусоbacterium smegmatis 377, Staphylococcus аиrеиs 144, а также три штамма дрожжей (Сапdida guilliermondii 217, Rhodotorula aurantiaca 226, Sассhаrотусеs сerevisiae 230), грибы (Аsреrgillus niger 369, Fиsаriuт охуsроrит).