Физические методы исследования биологических объектов

hν = gβB₀.

Поглинання енергії СВЧ поля спостерігається в тому випадку, коли між іовнями існує різниця заселеності.

       При тепловій рівновазі існує невелика різниця заселеності зеемановских рівней, овизначуваної больцмановським розподілом

 N ₊ / N ₋ = exp(gβB₀/kT).

В такій системі при збудженні переходів деже швидко повинна наступити рівновага заселенностей енергетичних підрівней і зникнути поглинання СВЧ поля. Проте, в дійсності, є багато різноманітних механізмів взаємодії, в результате яких електрон безвипромінювально переходить в первинний стан. Еффект незмвнності інтенсивности поглинання при збільшенні потужності виникає за рахунок електронів, не встигаючих релаксувати, і називається насиченим. Насичені появляються при високій потужності СВЧ випромінюванню і може необхідно шукати результати вимірювання концентрації центрів методом ЕПР.

 Значення методу

Метод ЕПР дає унікальну інформацію про парамагнітні центри. Він однозначно розрізнює домішкові іони, ізоморфно включені в решітку від мікровключень. При цьому отримується повна інформація про даний йон в кристалі: валентність, координація, локальну симетрія, гібридизація електронів, в  які структурні положення він входить, ориентацію осей кристалічного поля в місці розташування цього йону, повна характеристика кристалічного поля і детальні відомості про хімічний зв’язок. І, що дуже важливо, метод дозволяє визначити концентрацію парамагнітних центрів в областях кристалу з різною структурою.

  Але спектр ЕПР це не лише характеристика йону в кристалі,але і самого кристалу, особливостей розподілу електронної густини, кристалічного поля, іонності-ковалентності в кристалі та просто діагностичної характеристики мінералу, так як кожний йон в кажному мінералі має свої унікальні параметри. В цьому випадку парамагнітный центр є своєрідним зондом, що дає спектроскопічні та структурні характеристики свого мікрооточення.

Ця властивість використовується в т. н. методі спінових міток і зондів, заснований на введенні стабільного парамагнітного центра в досліджувану систему. В якості такого парамагнітного центру, як правило, використовують нітроксильний радикал, що характеризується анізотропними g и A тензорами.

  Багато  біологічних систем не містять груп з неспареними електронами. Щоб досліджувати такі системи методом ЕПР, в них вводять зонд, що специфічно зв'язується, який містить радикал. Найбільш поширеними зондами, або мітками спинів, є похідні нітроксильного радикалу. При введенні їх в біологічну систему необхідно дотримуватися певної обережності і переконатися в тому, що властивості системи істотно не міняються. При вдалому включенні такої мітки вона може служити вельми чутливою репортерською групою

Техніка отримання спектрів

  Існують два основних типи спектрометрів, що базується на неперервній та імпульсній дії на зразок.

В спектрометрах  неперервного випромінювання зазвичай реєтрується не лінія резонансного поглинання, а похідна цієї лінії. Це пов’язано, по-перше, з великою чіткістю прояву окремих ліній в складних спектрах, по-друге, з технічними удобствами реєстрації першої похідної. Резонансному значенню магнітного поля відповідає перетин першої похідної з нульовою лінією, ширина лінії вимірюється між точками максимуму та мінімуму.

  З наведеного вище рівняння витікає, що резонансне поглинання СВЧ енергії може виникнути або при зміні довжини хвилі або при зміні напруженості магнітного поля. Для підвищення чутливості методу використовують високочастотну модуляцію магнітного поля B₀, при цьому фіксується похідна спектру поглинання. Діапазон реєстрації ЕПР визначається частотою ν чи довжиною хвилі  λ СВЧ випромінювання при відповідній напруженості магнітного поля B₀ (див. таблицю). 

 Найбільш часто експерименти проводяться в X- та в Q-діапазонах ЕПР. Можливості методу значно розширюються при переході в більше високочастотні діапазони СВЧ. Можна відмітити наступні переваги міліметрової ЕПР спектроскопії:

-высоке спектральне розширення по g-фактору, пропорційне частоті регістручих ν або напруженості зовнішнього магнітного поля B₀ .

-в міліметрових діапазонах ЕПР збільшується чутливість методу до оріентації розупорядковуючих систем в магнітному полі.

-завдяки великій енергії СВЧ квантів в цих діапазонах появляється можливість дослідження спінових систем з більш сильним розщепленням в нульовому полі.

-при реєстрації спектрів ЕПР в високих магнітних полях вони стають більш простими через зменшення ефектів другого порядку.

-в високих магнітних полях збільшується інформативність імпульсних методів.

ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА ДОПОМОГОЮ ЕПР МЕТАЛОВМIСТНИХ  БІЛКІВ

Далеко не всі  біологічні молекули володіють неспареним електроном, але деякі білки містять  парамагнітні іони металів, які грають важливу роль в їх функціонуванні і у формуванні структури. При  дослідженні таких білків ЕПР виявляється особливо цінним методом. У спектрах протонного резонансу сигнали від безлічі ядер розташовуються у відносно вузькому спектральному інтервалі. У спектрах ЕПР проблема накладення різних сигналів усувається автоматично, оскільки є лише одне джерело сигналів — іон металу разом з його оточенням. По суті цей іон є природною міткою. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

е)Флуорисцентна  спектроскопiя

Рис. Нормальні  спектри флуоресценції, отримані при  збудженні світлом з X = 240 — 250 нм сироваткового альбуміну людини (1), триптофана (2), суміші тирозина і триптофана в молярному відношенні 18:1 (крива 3). Таке ж співвідношення між цими амінокислотами має місце і в сироватковому альбуміні. Відзначимо, що спектр цього білка дуже нагадує спектр триптофана, якщо не вважати, що останній зрушений у   довгохвильову область. 

 Флуоресценція чутливіша до оточення, чим поглинання, оскільки процеси випускання охоплюють порівняно довший період часу. Можна реєструвати стаціонарні спектри випромінювання або досліджувати дійсну кінетику згасання випромінювання. При достатньо близькому розташуванні двох хромофорiв відбувається перенесення енергії. Порушуючи один хромофор, можна спостерігати флуоресценцію іншого. Вірогідність перенесення назад пропорційна шостому ступеню відстані між хромофорамі. Таким чином, вимірюючи ефективність перенесення енергії, можна знайти відстань між двома характерними точками макромолекули. При пропусканні через жорсткі або заморожені зразки поляризованого світла спостерігається переважне поглинання хромофорами, моментами переходів, що володіють, орієнтованими паралельно напряму поляризації. У відсутність молекулярного руху флуоресценція матиме граничну поляризацію. Характерний час обертання молекул типових білків і нуклеїнових кислот в розчинi складає від 10 до 100 не, тоді як час загасання флуоресценції лежить в інтервалі від 1 до 30 не. Таким чином, спостережуваний для розчинів ступінь поляризації визначається співвідношенням між часом загасання флуоресценції і молекулярного обертання. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

ж) Спектроскопiя комбiнативного розсiння

Ще одним методом, що дозволяє отримати інформацію про  коливальні стани молекул, є спектроскопія  комбінаційного розсіяння. Хай на зразок падає інтенсивний пучок світла частоти v. У молекулах зразка індукуватиметься осцилюючий дипольний момент, навіть якщо при частоті v не відбувається електронне або коливальне збудження.

Полярізуємость молекули, що коливається, не залишається постійною в часі. Рухи ядер викликають зсуви електронів, і будь-якому даному положенню ядер відповідає своя полярізуємость. Цю залежність можна представити у вигляді

а(v)= a0(v)+ а'(v) cos 2nv't

де a0 — полярізуємость молекули при рівноважному положенні ядер, а'(v) описує зміну полярізуємості при зсувах ядер, v' — частота коливань.При опромінюванні молекули, що коливається, світлом частоти v випромінюється світло з частотами v + v'. Положення смуг випускання (щодо положення збудливого піку) дає значення коливальної частоти v'. Спектральна смуга з частотою, меншою, ніж у збудливого світла, називається стоксовою, а з більшою — антістоксовою. Може показатися парадоксальним, що зразок здатний випускати фотони, енергія яких більша, ніж у збудливих фотонів. Відзначимо, проте, що спектри комбінаційного розсіяння породжуються двохфотонними процесами. Якщо система поглинає два фотони частоти v і випускає один фотон частоти v — v', а інший — v + v'.тo сумарна зміна енергії рівна нулю 1К

  Згідно квантової теорії, антістоксова компонента при комбінаційному розсіянні спостерігається тоді, коли фототи розсіюеться на молекули, що знаходяться на збудженому коливальному рівні, який відповідає коливанню з частотою v'. В цьому випадку після розсіяння молекула втрачає енергію коливального кванта Л до', а частота розсіяного фотона збільшується на величину v'. Зазвичай антістоксова компонента має незначну інтенсивність, оскільки для частот, з якими має справу метод комбінаційного розсіяння, вірогідність знаходження молекули в коливає-збудженому стані дуже мала.

У разі малих  молекул спектроскопія комбінаційного розсіяння доповнює інфрачервону спектроскопію. Для появи смуг комбінаційного розсіяння необхідно, щоб рухи ядер приводили до зміни поляризуємості, а не постійного дипольного моменту. Тому деякі переходи, насилу спостережувані одним методом, можуть виявитися у вигляді вельми інтенсивних смуг, якщо скористатися іншим. У разі великих асиметричних молекул обидва методи реєструють одні і ті ж смуги. Основною перевагою спектроскопії комбінаційного розсіяння є те, що вода тут поглинає досить слабо. Отже, метод зручний при вивченні біологічних систем у водних розчинах. 

РИС. Спектр комбинационного рассеяния интактного бактериофага MS2, полученный с использованием аргонового лазера. Экспериментальные условия: 60 мг-мл^-1 MS2 в 0,75 М водном растворе КС1 при 32 °С. Внизу приведены линии комбинационного рассеяния, характерные для различных групп белков и нуклеиновых кислот.

Спектроскопія комбінаційного розсіяння знаходить  особливо широке застосування при дослідженні  комплексів білків з нуклеїновими кислотами. Спектри комбінаційного розсіяння навіть таких складних об'єктів, як цілі бактеріофаги, складаються з великого числа добре дозволених смуг (див. мал. ). Багато з цих смуг вдається співвіднести з коливаннями пептидної групи або бічних груп білкової молекули або ж з коливаннями фосфатних груп або азотистих основ нуклеїнових кислот, а деякі з них виявляються чутливими до конформацiями. Так само як і у разі інфрачервоних спектрів, смуги спектрів комбінаційного розсіяння зрушуються і розщеплюються при зміні конформацій системи. Окрім вимірювань можна визначати розмір і форму макромолекул, а також досліджувати гнучкість структур, що вивчаються.

Методами інфрачервоної  спектроскопії і спектроскопії  комбінаційного розсіяння вивчають молекулярні коливання. Оскільки ці коливання часто бувають пов'язані з певними групами атомів, дані методи в принципі дозволяють отримувати детальну інформацію про структуру макромолекул. Коливальні спектри поглинання, як і електронні спектри, чутливі до конформації молекул і до взаємодії між сусідніми хромофорами. Проте на практиці ці методи використовуються рідше за інших, оскільки для вимірювань необхідні великі кількості речовини; виняток становить новітня лазерна спектроскопія комбінаційного розсіяння.